槲皮素对achn肾癌细胞恶性生物学特征及其vegf表达的影响 (1)

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1、安徽医科大学硕士学位论文恶性生物学特征的影响，进一步探讨其抗肿瘤的分子的机制，为槲皮素的临床应用提供理论依据。血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)是一种高度特异性的血管内皮细胞有丝分裂素，通过与其特异性受体(VEGFR)结合，通过一系列信号传导，刺激血管内皮细胞增殖和血管通透性增加，促进新生血管生成。VEGF主要生物学功能活性：1).增强微血管渗透性的能力，血管高渗透性可导致多种血浆蛋白,包括纤维蛋白原及其他凝固蛋白的外漏，导致纤维蛋白在细胞外间质沉积,最终可延缓水肿液体的清除,从而使正常组织抗血管生成向促血管生成转化[12]。

2、2).内皮细胞的激活:VEGF促使血管内皮细胞形态学的改变、细胞骨架的变更以及刺激内皮细胞生长和迁移。3).促进浸润和迁移:降解基底膜是上皮细胞浸润和迁移的必要的,是启动血管生成的重要早期步骤。VEGF通过诱导降解过程中的多种酶和蛋白,促进周围环境的降解，从而利于内皮细胞浸润和迁移。在众多的血管生成因子中VEGF是一种与肿瘤血管生成关系最为密切的生长因子，肿瘤细胞旁分泌和自分泌促血管生成因子，进而促进血管内皮的生长，促进新生血管形成，诱导宿主毛细血管新生并长入肿瘤组织，这是肿瘤新生血管形成的决定因素之一。而肿瘤血管形成确保了肿瘤代谢的进行，是肿瘤生长、侵袭、转移必不可少的因素。在人类

3、许多恶性肿瘤包括乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、肾癌等原发癌组织中均可见VEGF的高表达[13-15]。因此抑制肿瘤血管生成可以被认为抑制肿瘤生长的重要治疗方法，越来越多的研究证实通过抑制VEGF及信号通路可以抑制肿瘤血管生成，阻断肿瘤生长所需的血供与营养供应，从而抑制肿瘤的生长与转移，VEGF成为一种重要的抗肿瘤血管生成的靶向治疗[16]。9安徽医科大学硕士学位论文第一部分槲皮素对ACHN肾细胞癌细胞VEGF蛋白表达的影响1材料及设备1.1主要仪器DYY-Ill2型稳压稳流电泳仪北京六一仪器厂ZFP型紫外手提式分析仪上海长明光学电子仪器厂TGL-16B台式离心机上海安亭科学仪器厂E

4、ppendorf冷冻台式离心机法国Eppendorf公司752紫外光栅分光光度计上海第三分析仪器厂DK-SD型电热恒温水槽上海医用恒温设备厂UVP图象处理仪上海青浦沪西仪器厂YKH-I型液体快速混合器江西医疗器械厂倒置显微镜日本奥林巴斯公司酶标仪Multisranspectrum美国Thermo公司凝胶电泳成像分析系统美国Bio-Rad公司UVP图象处理仪上海青浦沪西仪器厂-30℃冰柜中科美菱公司-70℃冰箱中科美菱公司红血球计数板上海青浦沪西仪器厂6孔培养板及培养瓶美国constar公司24孔培养板及培养瓶美国constar公司96孔培养板及培养瓶美国constar公司培养皿美国c

5、onstar公司C02细胞培养箱美国Thermo公司各型移液枪、枪头美国constar公司10安徽医科大学硕士学位论文酸度计意大利Hanna公司1.1主要试剂槲皮素美国Sigma公司胎牛血清Hyclone公司RPMI-1640细胞培养液Gibco公司胰蛋白酶Gibco公司四甲基偶氮唑盐(MTT)Sigma公司DAB显色试剂盒Sigma公司羊抗鼠VEGF单克隆抗体Abcam公司兔抗人β-actin多克隆抗体Sigma公司1.2主要试剂的配制1.3.130%丙烯酰胺称取308g单体Acyl/Bis37.5:1premixpower(Ameresco,Lot#0236B027)，溶于超纯水

6、中（避光），定容至1L。室温避光保存。1.3.210%SDS称取5gSDS（TBD，Cat#.16956）溶于超纯水中，定容至50ml。注：SDS较难溶，可以加热助溶，或放置较长时间即可溶解，不要剧烈吸打，以免形成过多气泡。室温保存。1.3.31.5MTris-HCl（PH8.8）及1.0MTris-HCl（PH6.8）称取计算好的TrisBase溶解于超纯水中，用浓盐酸调PH后，定容到相应体积。室温保存。1.3.410%APS称取0.1gAP溶于1ml水中，现用现配。1.3.5GlycineBufferTris-base3.03gGlycine18.8gSDS1.0g用水调至1L1

7、1安徽医科大学硕士学位论文1.1TransferBuffer（4℃保存）Tris5.8gGlycine2.9gEthanol200mlSDS0.37g用水调至1L1.210×丽春红贮存液丽春红2g三氯乙酸30g磺基水杨酸30g加水至100ml；用时用水稀释（1：9）至工作液1.3TBSTTris2.4228gNaCl8.766gTween-200.5ml用去离子水调至1L1.45%nonfatmilk（现用现配）5g奶粉溶于100mlTBST中1.5一抗二