microrna-133a在心肌梗死大鼠心肌纤维化中作用及机制

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1、本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：望查堕日期：2竺∑年三月翌日本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论

2、文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。期：旦年三月盟日』博士学位论文摘要目的microRNA(miRNA)是一类生物体自身产生的非编码蛋白质的小分子RNA，通过调控基因转录和／或翻译水平的表达，广泛参与生命进程及疾病发生发展。研究发现miRNA与心肌纤维化、心肌肥厚等心血管疾病的病理生理关系密切。心肌梗死是严重危害人类健康的心血管疾病，心梗后出现的心肌纤维化能影响心脏功能甚至诱发猝死等不良预后。本实验观察miR一133a及转化生长因子B1(transforminggr

3、owthfactor—B1，TGF—B1)和结缔组织生长因子(connectivetissuegrowthfactor，CTGF)在心梗大鼠不同时间点的表达变化；通过9型重组腺相关病毒(recombinantadeno-associatedvirus9，rAAV9)上调心梗后miR-133a表达，观察miR一133a过表达对TGF-B1、CTGF转录和翻译水平的影响及对心肌纤维化的调控作用，探讨miR-133a在心肌梗死后心肌纤维化中的作用及机制。方法：1．通过冠状动脉前降支缝扎法，建立心肌梗死大鼠模型，随机分为1周、2周、4周组，另设假手术

4、组(Sham组)。采用心脏超声检测心功能相关指标，Masson染色观察心肌胶原容积分数(collagenvolumefraction，CVF)、免疫组化法检测I、Ⅲ型胶原表达；并用实时荧光定量PCR法(realtime—qPCR)检测心肌miR-133a及TGF—B1、CTGFmRNA表达改变，蛋白印迹法(westernblot)检测TGF—B1及CTGF蛋白的表达变化。2．构建携带大鼠miR一133a基因及标记基因绿色荧光蛋白ZsGreen的AAV质粒载体，基因测序，酶切、PCR鉴定。在293细胞中包装病毒载体rAAV9-ZsGreen—p

5、re—miR一133a，提取纯化后测定滴度。博士学位论文摘要3．通过冠脉灌注法分别转导PBS缓冲液、rAAV9一ZsGreen和rAAV9-ZsGreen-pre-miR-133a至大鼠心脏，再行冠状动脉前降支缝扎手术，分别设为PBS组、ZsGreen组和miR-133a组。同时另设Sham组。荧光显微镜观察绿色荧光表达分布情况。4周后，采用心脏超声检测心功能相关指标，Masson染色观察CVF、免疫组化法检测I、ⅡI型胶原表达；并用realtime—qPCR检测心肌miR-133a及TGF-B1、CTGFmRNA表达改变，westernbl

6、ot检测TGF-131及CTGF蛋白的表达变化。结果：1．与Sham组比较，心梗4周组大鼠心功能明显降低(P0．05)，2周后出现显著升高(P

7、水平为Sham组的22±6％。3．心肌TGF-B1和CTGF的mRNA及蛋白表达水平均在心梗后出现显著升高(P

8、毒后，生物滴度测定显示病度为2×i07TU／ml。5．荧光显微镜下观察，ZsGreen组及miR-133a组心肌组织有大量绿色荧光广泛均匀分布。导入携带miR-13