免疫酶组织化学技术ppt课件

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1、免疫酶组织化学技术第一节基本原理抗原＋抗体（特异性）＋酶标记抗体，通过酶与底物作用生成有色反应物，定位组织或细胞内抗原的一门技术。免疫酶组化免疫学(抗原抗体反应)酶细胞化学(底物显色反应)+特异性敏感性定位性可视性PAP法免疫酶组织化学基本组成：抗原↓抗体↓放大系统↓显色系统ABC法免疫酶特点：信号定位准确标本可长期保存阳性标记与病变关系方法简便，易推广一、酶及其特点酶选择标准：★该酶用细胞化学易于被检出，能被光镜或电镜观察。★酶反应产物须稳定，不扩散，具有良好定位。第二节酶和底物★酶易于纯化，获得纯制品

2、。★酶与免疫球蛋白结合后，不丧失其活性。★酶在PH中性液内较稳定。★组织中不应存在与底物作用的内源性酶。符合上述条件：辣根过氧化物酶碱性磷酸酶葡萄糖氧化酶（一）辣根过氧化物酶（HRP）★分子量（40000），不会遮盖抗原的结合部位★稳定，易获得较高纯度酶★具有较高活性及特异性★可溶性佳，生成的产物不扩散★组织中内源性酶较少★可作用于多种底物，产生不同颜色★HRP穿透力强，易进入细胞内（二）碱性磷酸酶（AKP）从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取●组织穿透能力较弱●内源性AKP较高●左旋咪唑具有抑制作用（三）葡萄糖

3、氧化酶（GOD）底物为葡萄糖，终产物稳定●体内无内源性GOD●分子量大，穿透力较弱二、底物及其特点酶＋底物→酶·底物→酶＋产物（显色）HRP的底物：HRP的底物为低浓度的H2O2，供氢体为胺类及酚类化合物。HRP显色反应：HRP＋H2O2HRP＋H2O＋电子供体（氧化型）电子供体电子供体被氧化后，迅速改变颜色，通过聚合等反应，生成不溶性有色颗粒，并就地原位沉淀。HRP常用的电子供体：●3.3-二氨基联苯胺(DAB)～棕色●氨乙基卡巴唑(AEC)～红色，易溶于有机溶剂，易扩散，用水溶性封固剂。●4-氯-1-

4、茶酚（4CN）～蓝色，易弥散，不能久保存●3.3，5.5-四甲基联苯胺(TMB)～黄色AKP底物：AKP常用的底物为α-萘酚AS-B1磷酸盐偶联试剂：固兰BB～蓝色固红TR～红色第三节酶标记抗体法酶标记抗体法（EnzaymeLabelledantibody）是将酶通过共价键结合在抗体分子上，制备成酶标记抗体，通过抗体去寻找相应抗原。一、直接法原理：HRP标记在特异性抗体（第一抗体）上，抗原---抗体●HRP复合物组织抗原第一抗体过氧化物酶直接法步骤：一步完成特点：方法简便、省时，专一性强，非特异染色轻，但

5、敏感性差，一种标记抗体只能检测一种抗原。二、间接法原理：HRP标记在第二抗体上，抗原---特异性抗体---第二抗体●HRP复合物步骤：二步法组织抗原第一抗原第二抗体过氧化物酶间接法特点：敏感性较直接法高，一种标记抗体能用于相应动物制备的多种特异性抗体，检测多种抗原。但较直接法费时，非特异染色稍重。第四节酶抗酶法●制备抗酶抗体●制备PAP复合物酶桥法组织抗原第一抗体第二抗体第三抗体（抗酶抗体）HRP一、PAP法原理：抗原---特异性抗体---第二抗体（桥抗体）---PAP复合物步骤：三步法组织抗原第一抗原第

6、二抗体PAP复合物PAP法HRP特点：敏感性较高，背景染色较轻但特异性抗体与PAP必须为同一种属动物二、双PAP法：原理：在PAP的基础上再重复第二抗体和PAP复合物抗原---特异性抗体---第二抗体（桥抗体）---PAP---第二抗体---PAP复合物组织抗原第一抗原第二抗体PAP复合物双PAP法HRP双PAP法组织抗原第一抗原第二抗体PAP复合物HRP步骤：五步法特点：敏感性较高缺点：但步骤多，费时，非特异背景重三、APAAP法原理：抗原---特异抗体---第二抗体---APAAP复合物步骤：三步法A

7、PAAP法特点：非特异背景较轻，不受内源性酶的干扰。但产物易溶于有机溶剂第五节卵白素---生物素Avidin为一种硷性糖蛋白，由四个相同亚基组成Biotin小分子维生素Avidin和Biotin具有较高亲和力一、ABC法AvidinBiotinComplex原理：酶标记Biotin形成酶素化Biotin酶素化Biotin＋Avidin---ABC复合物抗原---特异抗体---Biotin标记第二抗---Avidin●Biotin●HRP组织抗原第一抗体第二抗体HRP生物素卵白素ABC法步骤：三步法特点：敏

8、感性较高，特异性强，应用范围广●某些脏器存在内源性生物素干扰●Avidin与核酸及细胞膜中磷脂有非特异反应SABC法StreptavidinbiotinPeroxidaseComplexSABC法已代替ABC法二、LSAB法LabelledStreptavidinBiotinMethod原理：●Biotin标记第二抗体LSAB法●HRP标记Avidin抗原---特异性抗体---Biotin标记第二抗体---Avidin●HRP