免疫酶组织化学和ELISA

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1、免疫组织化学和ELISA基本原理抗原＋抗体（特异性）＋酶标记抗体，通过酶与底物作用生成有色反应物，定位、定量组织或细胞内专心做生物抗原的技术。-生物秀www.bbioo.com免疫组化免疫学+酶细胞化学(抗原抗体反应)(底物显色反应)专心做生物-特异性敏感性定位性可视性生物秀www.bbioo.com免疫组织化学基本组成：抗原↓抗体↓放大系统↓显色系统免疫组化特点：信号定位准确定性检测专心做生物-标本可长期保存方法简便生物秀www.bbioo.com显色系统：酶和底物一、酶选择标准：★该酶用细胞化学易于被检出，能被光镜或电镜观察。专心做生物-★酶反应产物稳定，不扩散，具有良

2、好定位。生物秀www.bbioo.com★易于纯化，获得纯制品。★与免疫球蛋白结合后，不丧失其活性。专心做生物★在PH中性液内较-稳定。★组织中不应存在与底物作用的内源性酶。生物秀www.bbioo.com符合上述条件：辣根过氧化物酶碱性磷酸-专心做生物酶葡萄糖氧化酶生物秀www.bbioo.com（一）辣根过氧化物酶（HRP）★分子量（40000），不会遮盖抗原的结合部位★稳定，易获得较高纯度酶★具有较高活性及特异性专心做生物★可溶性佳，生成的产物-不扩散★组织中内源性酶较少生物秀★可作用于多种底www物，产.bb生不ioo同颜.c色om★HRP穿透力强，易进入细胞内（二

3、）碱性磷酸酶（AKP）从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取●组织穿透能力较弱专心做生物-●内源性AKP较高生物秀●左旋咪唑www具有.bbi抑oo制.com作用（三）葡萄糖氧化酶（GOD）底物为葡萄糖，终产物稳定专心做生物●体内无内-源性GOD●分子量大，穿透力较弱生物秀www.bbioo.com二、底物及其特点专心做生物酶＋底物→-酶·底物→酶＋产物（显色）生物秀www.bbioo.comHRP的底物：HRP的底物为低浓度的HO，22专心做生物-供氢体为胺类及酚类化合物。生物秀www.bbioo.comHRP显色反应：电子供体HRP＋HOHRP＋HO＋电子供222专心做生物体（氧

4、化型）-电子供体被氧生物秀化后，迅速改变颜色，通过聚合等反应，生成不溶性有色www颗粒，.bb并就地ioo原位.com沉淀。HRP常用的电子供体：●3.3-二氨基联苯胺(DAB)～棕色●氨乙基卡巴唑(AEC)～红色，易溶于有机溶剂，易扩散，用水溶性封固剂。专心做生物-●4-氯-1-茶酚（4CN）～蓝色，易弥散，不能久存●3.3，5.5-生物秀四甲基联苯胺(TMB)～黄色www.bbioo.comAKP底物：AKP常用的底物为α-萘酚AS-B1磷酸盐专心做生物-偶联试剂：固兰BB～蓝色生物秀www.bbioo.com固红TR～红色I酶标记抗体法酶标记抗体法（EnzymeLab

5、elledantibody）是将酶通过专心做生物共价键结合在抗体-分子上，制备成酶标记抗体，通过抗体去生物秀寻找相应抗原。www(直接.法、bbioo间接.com法）一、直接法HRP标记在特异性抗体（第一抗体）上，抗原-抗体●HRP复合物专心做生物组织抗原特点：一步完成，方法简便-、省时，专一性强，非特异染色轻，第一抗体但敏感性差，一种标记抗体只过氧化物能检测一种抗原。生物秀酶www.bbioo.com直接法二、间接法HRP标记在第二抗体，抗原-特异性抗体-第二抗体●HRP复合物特点：敏感性较直接法高，一专心做生物种标记抗体能用于相应组织抗原-动物制备的多种特异性第一抗体第

6、二抗体抗体，检测多种抗原。过氧化物酶但较直接法费时，非特异染色稍重生物秀间接法www.bbioo.comII:卵白素---生物素系统Avidin为一种硷性糖蛋白，由四个相同亚基组成专心做生物-Biotin小分子维生素Avidin和Bio生物秀tin具有较高亲和力www.bbioo.com一、ABC法（AvidinBiotinComplex）原理：酶标记Biotin形成酶素化Biotin专心做生物-酶素化Biotin＋Avidin---ABC组织抗原复合物第一抗体抗原---特异抗体---Biotin标记生物秀第二抗体第二抗--Avidin●Biowwwtin●HRP.bbio

7、o.cHomRP生物素AvidinABC法特点：三步法，敏感性较高，特异性强，应用范围广，但某些组织中存在高内源性生物素干扰A专心做生物vidin与核酸及细-胞膜中磷脂有非特异反应Streptavidin生物秀biotinPeroxidaseComplexSABC法已代替ABCwww法.bbioo.com新近出现的方法多聚合物酶法（HRP-多聚合物-抗体）专心做生物Epos法（Enha-ncedpolymerone-stepstaining）EnVision法生物秀www.bbioo.com多聚合物酶法专心做生物-