《酶组织化学》ppt课件

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1、酶组织化学掌握内容酶组织化学的基本原理光镜酶组织化学的基本方法几种重要的酶组织化学方法概述酶的组织化学利用细胞内的酶具有催化底物的特性，并通过显色反应在切片或涂片上显示组织或细胞中内源性酶的活性及其定位的方法特点：①在原位检测②检测酶的活性而不是酶分子本身酶组织化学发展历史1939年以前：主要研究细胞内的氧化还原反应，未出现酶组织化学方法（如Klebs和Stuve指出愈创木酯酊同脓作用能产生蓝色——过氧化物酶）1939年：酶组织化学真正开始高松英雄和Gomori——碱性磷酸酶（硫化钴反应、银反应）同年，酸性磷酸酶组织化学方法也发表酶组织化学发展历史1940-1950年：酶组织化学发展的黄金时

2、期创立了金属盐法、偶联偶氮色素法50年代后：电镜酶组织化学将超薄切片法和电镜技术应用到酶组织化学上，获得了酶的更精确的定位60年代后期：免疫组织化学利用抗原抗体特异性反应来定位酶蛋白电镜免疫组化酶的种类1.氧化还原酶2.转移酶3.水解酶4.裂合酶（裂解酶）5.异构酶6.合成酶（连接酶）目前，能用酶组织化学方法显示出来，并可进行定性、定位和定量的酶较少，仅200余种，因此潜力巨大。（一）酶的特性水溶性，易扩散，难溶或不溶于有机溶剂有机溶剂不同程度降低酶的活性易受温度影响，对热耐受性弱对干燥耐受性强酶组织化学反应的基本知识（二）酶的定位酶在细胞内或超微结构中存在的特定部位如：5’-核苷酸酶——浆

3、膜ATPase——肌球蛋白细胞膜线粒体（三）酶组化的基本条件同时保存结构和酶的活性保存酶的定位，防止酶的扩散或移位保证反应产物的特异性*影响酶活性的因素：温度PH值抑制剂激活剂基本原理细胞内的酶催化分解合适的底物，生成中间产物（即初级反应产物），然后其中之一再与辅助物（或捕捉剂）反应，生成有色不溶性的终反应产物，该反应产物沉积在原位，以显示酶的存在（四）原理及一般原则第一反应：酶促反应底物初级反应产物（PRP）不可见第二反应：捕捉反应PRP+捕捉剂终反应产物（FRP）酶*PRP弥散：1.底物在酶催化下反应的速度2.PRP在缓冲液中的弥散系数3.PRP与辅助物反应的速度应选择合适的底物和辅助物

4、,减少弥散一般原则对组织处理,制片过程不能影响酶活性及分布所选底物和辅助物必须迅速、同步穿透入组织和细胞中所选底物最好只能被一种酶催化分解(一个底物可能同时发生几种酶反应，为获得特异酶反应，必须使用酶抑制剂或酶激活剂进行鉴别。)一般原则4.所选辅助物不影响细胞内酶的活性,不影响其他反应试剂的穿透性5.PRP必须迅速与辅助物反应,FRP为水不溶性的有色稳定产物6.所有参与反应的试剂均不能与其他成分吸附或结合(五)酶组织化学的主要步骤1、固定或不固定的标本2、切片(冷冻或不冷冻)3、孵育4、显色5、显微镜下观察（六）各步骤注意问题检测方法的选择酶的保存与固定一般新鲜组织快速冷冻,冰冻切片(-70

5、℃长期保存；可用［丙酮∶氯仿=1∶1］4℃，5～10分钟稍固定)固定剂:抑制酶活性和细胞化学成分活性的重金属盐Hg、Cr、Pb等不能用做固定剂；慎用醛类固定方法:浸泡固定灌流固定固定温度:0—4℃3.切片制作:切片厚度<40um，一般8～12um4.缓冲液选择缓冲液用于A.配置固定液B.漂洗液C.配置酶反应孵育液选择缓冲液应注意A.不能减弱目标酶的活性B.不能含有与捕捉机制相同的物质C.注意漂洗用缓冲液的渗透压D.漂洗用缓冲液原则上与固定液配置的缓冲液相同5.孵育反应A.孵育液配置:底物浓度量要足够1∶20(V/V);孵育液只能用一次，配制时要适量配制孵育液的要求⑴清洗器具，过酸冲洗。⑵现用

6、现配，保持新鲜。⑶严格配比，保持平衡。⑷防止污染，过滤为佳。⑸优选试剂，注意纯度。5.孵育反应B.孵育的温度和时间:37℃15-30minC.切片孵育法-切片孵育-漂浮孵育6.酶特异性对照实验用酶活性抑制剂采用无底物的孵育液过固定或加热用针对目标酶的激活剂改变孵育液底物选择PH酶细胞内的定位差异对结果的分析应考虑的问题1、经过冻结和固定后，酶究竟能保存多少？2、酶是否在原位？3、反应中酶起了多少作用？4、酶的活性是否代表了细胞生活时的状态？5、沉淀的产物是否能代表酶本身，时间延长，会不会改变？有没有扩散移位？显示酶的组织化学方法一、金属离子沉淀法（金属－金属盐法）金、银、铜、铁、铝、钴等金属

7、利用某些金属本身具有颜色或其化合物具有颜色（硫化钴，黑色；硫化铅，棕黑色等）原理：以酶作用于底物时，分解产物与底物混合液中的某种物质结合，沉着在作用的局部，接着用金属置换结合物质，通过金属显色来证明酶的反应。优点：反应迅速，沉着颗粒微细，色调美丽，且由于金属离子的高电子密度而可用于电镜组织化学研究。缺点：金属盐的移动、扩散和吸附现象一般用于显示磷酸酶。如：AKP，ACP，G-6-Pase、ATPase、TPP