蚓激酶重组逆转录病毒载体构建

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1、摘要蚓激酶(1umbrokinase，u【)作为一种新型的溶栓药物，正在广泛应用于心脑血管疾病的预防和治疗。目前临床应用的LK均是从蚯蚓体内直接提取，其制各工艺繁杂，产量较低，因而通过基因工程手段生产大量高纯度的LK己成为一种极有前景的途径。本试验在之前工作基础上构建了含有蚓激酶基因的重组逆转录病毒载体，然后以牛体做为生物反应器，在牛奶中瞬时表达蚓激酶，以期验证载体构建的合理性，为最终获得转基因奶牛等乳腺生物反应器提供一定的理论和实验依据。首先将含有山羊口，酪蛋白基因(8-casein)5’区调控序列03ce)、蚓激酶基因(iumbrokinase)以及牛生长激素基因poly

2、A(BOHpolyA)序列的表达盒克隆到骨架为Moloney小鼠白血病病毒(缺失基因组)、含有标记基因Ne08的逆转录病毒载体pLNCL中，构建了蟋激酶重组逆转录病毒载体pLN-BCP．Up。以生理擒水为溶剂，将质粒转染泌乳期奶牛乳腺小叶，收集不同时段奶样，采用纤维蛋门甲板溶圈法(FibrinAgarosePlateAssay。FAPA)检测其纤溶活性，结果显示，BCP作为乳腺特异性启动子能指导目的基因即蚓激酶基因在奶牛乳腺组织实现有效瞬时表达，并且根据FAPA法检测结果表明奶牛乳腺组织在注射重组质粒转染3h后，奶样即出现明显纤溶，6～16h纤溶活性达到最高，持续时间40～6

3、0h，有的甚至可达78h，以尿激酶标准品制作标准曲线计算出最高表达量约为400(OUK／L牛奶。将表达目的蛋白的奶样经SDS．PAGE凝胶电泳检测，结果显示：表达的蚓激酶分子量约为40kDa。表明牛奶中有蚓激酶的瞬时表达，分子量比理论计算值稍大。可能是其经糖基化等修饰的结果。由于现在没有获得针对蚓激酶的特异性抗体，所以未能进行Westernblot检测。关键词：蚓激酶：逆转录病毒：乳腺表达：FAPA；转基因AbstractLumbrokinase(LK)，asanew-antithromboticmedicine，hasbeenwidelyusedinprevention-a

4、ndtreatmentofischaemiccerebrovasculardiseasesbecauseofitsthrombolyticafunction．Atpresent,itisusuallyextractedfromtheearthworms，anditisdifficultandtime-consumingtopurify．Inordertosolvetheseproblems，wedevelopedanowmethodtoobtainLumbrokinasebymoansofgene吒ngineering．Recombinantretroviralvectorh

5、arboringLumbrokinasecDNAWasconstructed．LumbrokinasewasexpressedtransientlyinthemilkofCOWmammary#ands．Theexpressioncassette，includinggoatB-caseinpromoter(BCP)，u(cDNAandbovinegrowthhormone(BGH)polyA，WasclonedintopLNCLtoconstructtherecombinantretroviralvectorpLN—BCP-LKa．Afterinjectingtherecomb

6、inantplasmidintolactatingmammary#andsofcow,LKwasshowntoheexpressedtransientlyinthemilk．Thefibrinolysisactivityofthemilkwashighestin“16hourqafterinjectionandlab；tedfor40～60hours，therearesomesamplescouldlastfor78hoursThehighestexpressiondosewab40000UK／LThemilkcontainingtheexpressionproductWas

7、separatedonSDS—PAGE．TheresultindicatedthatthemolecularweightoftheproteinofinterestWas40kDa．ItindicatedthatLumbrokimueWasexpressedtransientlyinthemilkofCOwmammaryglands，butthemolecularweightofthisproteinWashigherthanwehavecaculated．Becausewedonothavethesp