浓香型大曲中酯化酶测定方法研究

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1、酿酒HQUORMAKINGV01．30．No．2Mar．，2OO3文章编号：1002—8110(2003)02—0018一o4浓香型大曲中酯化酶测定方法的研究王耀，范文来，徐岩2，刁亚琴，陆红珍(1．江苏洋河集团有限公司，江苏宿迁223725；2．江南大学生物i程学院，江苏无锡214036)摘要：对浓香型大曲的酯化酶测定方法作了研究。建立有机相反应体系来代替传统方法的水相反应，与传统测定方法(需反应100h)相比，它能简单、快捷检测大曲质量，适合工业化生产的要求。有机相中酯化反应条件为：在30mL正庚烷有机反应

2、介质中，35的条件下，0．15M的底物酸，己酸与乙醇的浓度比为1：1．25，加入15g(干曲)的大曲，仅用24h就能比较出大曲酯化力的高低。关键词：浓香型，大曲，酯化酶，酯化，测定方法中图分类号：TS262．31；TQ925文献标识码：A‘0前言酯酶(EaemseE．C．3．1．1．2)亦称羧基酯酶，是指可以水解羧酯键的酶【lI4J。但该酶也能催化合成低级脂肪酸酯LlJ。由于该酶既能催化酯的合成，也能催化酯的分解，因此，白酒业习惯分别称为酯化酶和酯分解酶[5-7J。酵母、霉菌、细菌中均含有酯酶[，6．。目前已经

3、发现，红曲霉、根霉中许多菌株有较强的己酸乙酯合成能力【5'。酯酶不同于脂肪酶。脂肪酶(缉磁e，E．C．3，1．1，3)是一类特殊的酯酶，全称Tr／acy／g／ycerdacy／hydro／aseo脂肪酶的正式名称是甘油酯水解酶。它既能将脂肪水解为脂肪酸和甘油，又能催化脂肪的合成【5．9J。按NovoNordisk公司的定义，脂肪酶是可以水解一类特殊的酯类——三羧酸甘油酯的酶，而酯酶则是可以水解羧酯键的酶【111。对大曲酯化力的研究开始于20世纪8o年代后期[12,13J，但广泛和深入的阐述大曲对浓香型酒生香的作

4、用却是在20世纪90年代[一·M一刮。传统的酯化力测定方法【6J，是利用皂化反应和反滴定法来测定。此法测定时间长，操作复杂。本文研究了利用有机相代替水相的酯化酶活力的测定。0．1传统酯化力的测定【6J6先用碱中和酯化液中的游离酸，再加入一定量的碱使酯皂化，过量的碱用酸进行反滴定，用酚酞作为指示剂。其反应式为：RC00H+NaOH—÷RC00Na+ROH2NaOH+Sq—一Na2S04+2H200，2优化后酯化力测定方法的原理近年来，酶在有机相中的生物催化作用因其潜在的工业用途而日益受到人们的重视[117,18】

5、。与水相催化相比，有机介质可以增加酯酶的热稳定性，增加非极性底物的溶解度，减少反应副产物，还可能影响酶的底物特异性及酶反应的平收稿日期：2o03—01—16衡方向和反应速度。有机溶剂相中酯化反应平衡点与速率同溶剂中水含量密切相关，有机溶剂作为反应介质时，在一个狭窄的初始含水量范围内，酶有较高的催化酯化活力。当初始加水量较低时，酶分子由于不能获得形成活力构象所必需的水，表现出较低的催化反应活力；当体系中水初始含量高时，从物理状态来看，在反应的初始阶段酶粉即发生粘结，产生吸附现象，无法均匀分散，故反应速率也降低。对

6、本研究而言，所加入的酶不是纯酯化酶，而是加入一定量的带水分的大曲，大曲含水量在12％左右，此时反应体系中的含水百分比约为6％左右，这虽然高于一般反应介质的最佳含水量【181，但仍处于微水范围。而且，反应所利用的酯化酶是从大曲颗粒里浸出来的，酶量很少，加上曲粉的间隔作用，这样的含水量是不会发生酶粘结现象的，因此采用无水有机溶剂与试剂进行酯化力的测定方法是可行的。现以正庚烷为有机溶剂来代替水相进行酯化力测定方法的优化，以期在尽可能短的时间内鉴别出大曲酯化能力的高低。由于大曲的酯化反应是可逆反应，因此不仅要优化条件以

7、确保酯化能力最强，同时还要确保在此条件下分解能力最差，只有酯剩余量多的条件才是最适条件。1试验材料1．1大曲1．1．1粉碎用微型植物粉碎机粉碎。筛孔~'lmm。1．1．2分样采用四分法。通常样品需要量500引。1．1，3大曲样品分类方法见参考文献[23】。1．2试剂1．2．1正庚烷，AR级，每瓶试剂(500ⅡlL)加入3og无水硫酸钠。1．2，2己酸，AR级，每瓶试剂(500ⅡlL)加入30g无水硫酸钠。1．2．3无水乙醇，AR级，每瓶试剂()加入30g无水硫酸钠。1．2．4pH4，6醋酸一醋酸钠缓冲液，配制方

8、法见参考文献【6J。维普资讯http://www.cqvip.com第2期王耀，等：浓香型大曲中酯化酶测定方法的研究·l9·1．2．5100m~100mL己酸乙酯的20％(v／v)乙醇溶液，配制方法见参考文献。1．3仪器恒温培养箱：上海恒三仪器厂。2测定方法2．1传统酯化力的测定方法具体见文献【6J。2．2优化后酯化力测定方法影响己酸乙酯合成反应的因素有很多，做单因素分析实验，对加入底