基质刚度通过ilk介导的yap活化调控乳腺癌细胞耐药性

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1、电子科技大学UNIVERSITYOFELECTRONICSCIENCEANDTECHNOLOGYOFCHINA硕士学位论文MASTERTHESIS论文题目基质刚度通过ILK介导的YAP活化调控乳腺癌细胞耐药性学科专业生物化学与分子生物学学号201521090306作者姓名吕晓莹指导教师刘贻尧教授分类号密级注1UDC学位论文基质刚度通过ILK介导的YAP活化调控乳腺癌细胞耐药性（题名和副题名）吕晓莹（作者姓名）指导教师刘贻尧教授电子科技大学成都（姓名、职称、单位名称）申请学位级别硕士学科专业生物化学与分子生物学提交论文日期2017.04论文答辩日期2017.05学位授予单位和日期电

2、子科技大学2017年06月答辩委员会主席评阅人注1：注明《国际十进分类法UDC》的类号。MatrixStiffnessModulatesResponsetoChemotherapeuticAgentsinBreastCancerCellsViaILKMediatedYAPActivationAMasterThesisSubmittedtoUniversityofElectronicScienceandTechnologyofChinaDiscipline:BiochemistryandMolecularBiologyAuthor:XiaoyingLvSupervisor:Prof

3、.YiyaoLiuSchool:SchoolofLifeScienceandTechnology摘要摘要乳腺癌是女性最高发的癌症之一，目前在临床上的主要治疗方式仍然为化疗。但是，治疗过程中乳腺癌细胞经常对化疗药物产生耐药性，因此探究其耐药的机制十分重要。在乳腺癌的发生发展过程中，由于胶原纤维的大量沉积，会导致乳腺基质的硬化，使乳腺基质刚度增加，这也是临床上乳腺癌诊断的常规指标之一。目前，耐药性机制的研究主要从药物失活、药物靶点改变、药物流出、DNA损伤修复、细胞凋亡抑制等方面入手，而基质刚度作为肿瘤微环境的力学因素之一，探究其与耐药性的关系的研究并不多见。因此，这方面的探究将可以

4、为阐明乳腺癌细胞的耐药机制提供新的方向，并为治疗药物的筛选提供新的依据。本研究中，以2D的方式，配置具有不同硬度的聚丙烯酰胺水凝胶，模拟体内乳腺癌不同阶段的组织刚度特征，探究基质刚度的变化对于乳腺癌细胞耐药性的影响及其影响机制。实验中将细胞培养在具有不同刚度（10kPa、38kPa、57kPa）的聚丙烯酰胺水凝胶的表面，用不同浓度的阿霉素处理细胞，分别探究阿霉素处理过后，刚度对于细胞增殖、凋亡、药物的内吞及外排的影响。首先，通过CellTwitter以及ki67的免疫荧光检测细胞的增殖，发现38kPa刚度上细胞的增殖显著强于10kPa和57kPa。然后，通过Calcein-PI双

5、染、WesternBlot实验探究了细胞凋亡，发现38kPa刚度上的细胞，Bcl-2/Bax比值增加，切割形式的caspase-3及PARP发生下调，同时凋亡细胞占比明显降低。接着，用共聚焦显微镜、流式细胞术的手段探究不同刚度上细胞对药物内吞的差别，发现38kPa刚度上细胞对药物的内吞较弱。进一步地，用流式检测药物外排，结果证明38kPa刚度上细胞外排作用较强，同时P-gp在mRNA以及蛋白水平上的表达都有提高。这说明38kPa的基质刚度能够通过增强药物外排来促进细胞的耐药过程。对此，本研究对38kPa刚度上细胞耐药性较强的分子机制进行了探究。通过对临床数据总结发现，高表达ILK

6、以及高表达YAP会使乳腺癌患者生存率降低。相比于正常人群，乳腺癌患者的ILK在mRNA水平的表达上调，乳腺癌IV期人群ILK的mRNA表达也要强于I期，而无论对于正常乳腺组织还是乳腺癌组织，ILK与YAP的表达都呈显著正相关。相应的，本研究采用WesternBlot、免疫荧光、RT-PCR、双荧光素酶报告基因实验、数据库分析等方法发现，38kPa刚度上细胞ILK的mRNA及蛋白表达水平明显提高，而抑制ILK后会导致细胞耐药性的降低。同时38kPa刚度上p-Merlin高表达，p-MST1、p-LATS1以及p-YAP低表达，YAP的入核水平增加，这些结果初步说明38kPa刚度上Y

7、AP处于活化状态。而当抑制ILK之后，会降低YAP的入I摘要核，同时p-MST1、p-LATS1以及p-YAP也发生相应变化。进一步的实验结果显示，38kPa刚度上，YAP的报告基因活性增加，同时YAP靶基因的表达也增加，这说明38kPa刚度上YAP的转录活性较高。当抑制YAP后，P-gp在mRNA水平的表达下降，这说明细胞的耐药性降低。以上结果证明，YAP的活化能够促进细胞产生耐药性。本研究的结论：基质刚度能够通过ILK介导的YAP活化调节乳腺癌细胞的耐药性。关键词：乳腺癌，基