细丝蛋白a调控表皮生长因子受体活化促进乳腺癌细胞增殖及迁移

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1、河北医科大学硕士学位论文细丝蛋白A调控表皮生长因子受体活化促进乳腺癌细胞增殖及迁移姓名：王捷申请学位级别：硕士专业：内科学指导教师：朱铁年201203中文摘要细丝蛋白A调控表皮生长因子受体活化促进乳腺癌细胞的增殖及迁移摘要目的：乳腺癌是威胁当代女性生命健康最主要的恶性肿瘤之一，2007年卫生部调查统计显示其临床发病率为我国女性所患恶性肿瘤之首。据统计全球乳腺癌的发病率和死亡率呈逐年上升趋势，而其发病机制至今仍未完全阐明。针对这一严峻形势，探索新的乳腺癌治疗思路，寻找更为有效的治疗靶点仍然是乳腺癌治疗领

2、域的研究热点。表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)家族属于受体酪氨酸激酶(receptortyrosinekinase，RTK)家族，是与乳腺癌关系最为密切的一类生长因子受体，包括erbB．1／EGFR、erbB．2／HER2、erbB．3／艇R3和erbB．4／HER4四大成员。受体与其相应配体结合导致受体上的酪氨酸磷酸化，通过信号转导参与调节细胞的增殖、分化及运动等，在正常乳腺的发育、成熟、退化过程中发挥着重要作用。四种受体在乳腺癌细胞通常呈现过

3、表达。许多研究资料证实HER-2阳性是乳腺癌患者预后不良的一大主因，而EGFR过表达也是乳腺癌患者预后的不利标志，但尚未发现ErbB．3、ErbB．4过表达对乳腺癌预后的显著影响。虽然针对EGFR、HER-2的分子靶向药物西妥昔单抗(cetuximab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)以及拉帕替尼(1apatinib)等均已应用于乳腺癌的临床治疗，但有效率不高，且伴有耐药问题，故开发更有效的抗EGFR及抗HER-2药物势在必行。细丝蛋白A(filamina，FLNa)是一种肌动蛋白结合蛋白(ac

4、tinbindingprotein，ABP)，其分子可交联肌动蛋白丝形成稳定的细胞骨架，并与多种细胞膜蛋白结合，参与细胞增殖、粘附、迁移、侵袭等多种行为。FLNa还干预细胞内多种受体的表达，从而影响多条信号转导通路，参与肿瘤的发生与发展。已有研究显示FLNa在肺癌、转移性乳腺癌、低分化星形细胞瘤、前列腺癌、黑色素瘤等多种肿瘤中的表达均增多。并有研究显示FLNa的表达量与乳腺癌的恶性程度密切相关，但详细机制仍不清楚。FLNa是否对乳腺癌细胞EGFR、HER．2的活化有影响，目前尚未见相关中文摘要报道。本

5、研究拟通过g(1)采用Westernblot检测不同乳腺癌细胞株中FLNa、EGFR、HER-2蛋白表达情况；(2)采用MTT、流式及划痕修复实验检测不同乳腺癌细胞的增殖及迁移能力；(3)质粒转染技术敲低或增加FLNa的表达后，观察乳腺癌细胞增殖能力、EGFR、HER．2酪氨酸磷酸化水平及其下游信号通路分子的变化。旨在从细胞、分子水平上分析FLNa对乳腺癌细胞增殖、迁移的影响，及其对表皮生长因子受体磷酸化及相应信号通路的调控作用，为更有效治疗乳腺癌寻找新靶点。方法：1Westernblot检测不同乳腺

6、癌细胞蛋白表达情况培养人乳腺癌MDA-MB．436细胞、MDA．MB．231细胞及SKBR-3细胞，收集细胞提取蛋白后进行Westemblot，依次检测各种细胞中FLNa、EGFR、HER-2的蛋白表达情况。2MTT比色分析法检测不同乳腺癌细胞的增殖能力将上述3种乳腺癌细胞消化计数后接种至96孔板，采用MTT法检测EGF(20nM)刺激24h后每种细胞的增殖能力。3流式细胞术检测不同乳腺癌细胞的细胞周期分布情况培养乳腺癌细胞48h后收集细胞，以70％乙醇4"C固定过夜，应用流式细胞仪(floweyto

7、metry，FCM)检测3种乳腺癌细胞的细胞周期分布情况。．4划痕修复实验观察不同乳腺癌细胞的迁移能力培养乳腺癌细胞，待细胞贴壁融合达90％以上进行划痕，分别于划痕后oh、6h、12h用倒置显微镜观察并拍照，利用软件测量划痕宽度变化。5质粒转染后MTT比色分析法检测细胞增殖能力选取人乳腺癌MDA-MB．436细胞(高表达FLNa)、SKBR-3细胞(低表达FLNa)进行质粒转染，敲低或增加细胞内FLNa的表达后，MTT比色法观察不同浓度EGF(4nM、20nM、100nM)刺激24h后细胞的增殖情况。

8、6激光共聚焦显微镜观察乳腺癌细胞内FLNa、EGFR、HER-2的定位培养MDA-MB．436细胞及SKBR-3细胞，用抗FLNa和抗EGFR的抗体，或抗FLNa和抗HER-2的抗体，及相应荧光二抗进行免疫细胞荧中文摘要光染色，用激光共聚焦显微镜(confocallaserscanningmicroscopy，CLSM)分别观察FLNa与EGFR、FLNa与HER-2的定位情况。7质粒转染后Westernblot检测细胞内蛋白表达情况将表达FLNa-si