流感病毒裂解疫苗中外源性禽白血病病毒荧光定量PCR检测方法的研究

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1、流感病毒裂解疫苗中外源性禽白血病病毒荧光定量PCR检测方法的研究刘巍2015年12月中图分类号：TQ028.1UDC分类号：540流感病毒裂解疫苗中外源性禽白血病病毒荧光定量PCR检测方法的研究作者姓名刘巍学院名称生命学院指导教师庆宏教授答辩委员会主席戴荣继教授申请学位工学硕士学科专业生物工程学位授予单位北京理工大学论文答辩日期2015年12月Studyofreal-timequantitativePCRfordetectionofexogenousALVinsplitinfluenzavirusvaccineCandidateName：We

2、iLiuSchoolorDepartment:SchoolofLifeScienceFacultyMentor:Prof.HongQingChair,ThesisCommittee：Prof.RongJiDaiDegreeApplied:MasterofEngineeringMajor：Bio-engineeringDegreeby:BeijingInstituteofTechnologyTheDateofDefence：December，2015研究成果声明本人郑重声明：所提交的学位论文是我本人在指导教师的指导下进行的研究工作获得的研究成果

3、。尽我所知，文中除特别标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得北京理工大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的合作者对此研究工作所做的任何贡献均已在学位论文中作了明确的说明并表示了谢意。特此申明。签名：日期：摘要流感病毒裂解疫苗作为预防大规模流感疫情的重要预防手段，能有效的预防流感引起的疾病和死亡。接种流感疫苗是被公认的预防流感发生与传播的最佳方法，用鸡胚作为病毒生长介质也是目前流感疫苗生产最常用的培养基质。在2010版《中国药典》新增流感病毒裂解疫苗品种，其中规定明确要求对其主

4、种子批中的外源性禽白血病病毒(AvianLeucosisVirus，ALV)进行检测，检测结果应为阴性。禽白血病病毒的检测目前主要依赖于病毒分离培养及酶联免疫吸附。血清学诊断由于检测时间长，需制备特异性抗体，存在生物安全隐患等不足之处。随着分子生物学检测技术的发展，为禽白血病病毒的准确检定提供了可能。应用普通PCR和RT-PCR方法可在1天内进行禽白血病病毒的鉴定和分型诊断，但两种方法均易造成标本间的交叉污染而得到假阳性结果。Taqman实时荧光定量PCR技术，相对于常规的PCR技术而言，具有更高的敏感性、特异性。而且还具有快速、高通量、污染

5、少等优点。从GenBank下载ALV-A、ALV-B、ALV-C、ALV-J等病毒基因组序列，寻找位于LTR区域的保守序列，设计引物探针。扩增保守区，获得质粒标准品，将含有保守序列的质粒标准品经过10倍系列稀释后，进行荧光定量PCR得到相应的扩增曲线和标准曲线。得到的标准曲线相关系数R2=0.998，扩增效率Eff=96.5%所做的标准曲线的有较好的线性关系。倍比稀释质粒标准品，从1×109稀释到1×101copies/μL。考察其敏感性，敏感性可达到10-1copies/μL。用建立的荧光定量PCR方法对ALV-A、ALV-B、ALV-C、

6、ALV-J等标准质粒进行检测，均可出现“S”型扩增曲线。说明该方法可检测四种亚型的禽白血病病毒。用建立的荧光定量PCR方法对小鼠白血病病毒、H1N1型流感病毒、H7N9型流感病毒等进行检测，扩增结果皆为阴性。表明所建立的针对外源性禽白血病病毒的荧光定量PCR方法特异性强，与其他病毒无交叉反应。本研究成功设计了针对外源性禽白血病病毒的特异性引物和探针，可实现对流感病毒裂解疫苗主种子批中的禽白血病病毒的快速检定，具有快速、敏感、特异等特点，并可对样品中病毒进行定量。I关键词：禽白血病病毒；外源性；荧光定量PCRIIAbstractInfluenz

7、avirusvaccineasanimportantmeansofpreventionofthepandemicoutbreakcaneffectivelypreventflu-relatedillnessanddeath.Nowthereisnotspecificmedicinetocureanyonefromgettingtheflu,butvaccinationisregardedasthebestmethodofinfluenzaprevention.Fertilizedhens’eggisthecommonchoiceinmanuf

8、acturinginfluenzavaccine.Inthe2010editionoftheChinesePharmacopoeiaaddedinfluenzavi