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1、针刺联合紫杉醇对小鼠Lewis肺癌细胞凋亡相关因子p53、bcl1实验材料1.1动物C57BL/6小鼠54只,雌雄各半,体重(20±2)g,京维通利华实验动物有限责任公司提供,合格证号：007250639,动物等级：SPF级。 1.2试剂及药物Leg/5mL,批号050401)；兔抗p53、Bcl-2一抗(北京中杉生物公司)；碱性磷酸酶的山羊抗兔IgG(北京中杉生物公司)；甘氨酸(GIBCO公司)；过硫酸铵(Promega公司)；牛血清白蛋白(BSA,北京元亨圣马生物技术研究所)；酚试剂(Sigma公司)；
2、硝酸纤维素膜(Immobilon-NCTransterMembranesMILLPORE),O-dianidine,25mgβ-naphthylacidphosphate(Sigma公司)。2实验方法2.1造模Le时,处死小鼠；选择生长良好的瘤组织,无菌取出,剪碎,研磨,过滤,制成单细胞悬液；台盼蓝染色观察记录活细胞数(>90%),调整细胞浓度至活瘤细胞计数约1×107个/mL瘤细胞,给每只实验组小鼠左后肢内侧皮下接种0.2mL(约含活细胞2×106个),即为荷瘤模型。 2.2分组接种后将动物均匀随
3、机分为4组,每组12只,雌雄各半,即肺癌模型组(模型组)、肺癌＋针刺“肺俞”组(针刺组)、肺癌＋紫杉醇注射液组(药物组)、肺癌＋紫杉醇＋针刺“肺俞”组(针药结合组)。电子商务论文发表 2.3紫杉醇注射液的制备取紫杉醇溶液30mg/5mL,加生理盐水25mL,制成1mg/mL的紫杉醇注射液。 2.4处理因素接种后第5天开始治疗,连续治疗10d。模型组：固定,每日每只腹腔注射等量生理盐水；针刺组：固定,针刺“肺俞”穴,每日1次；药物组：固定,每日每只腹腔注射紫杉醇注射液10mg/kg；针药结合组：固定,针刺
4、“肺俞”穴,20min后腹腔注射紫杉醇注射液10mg/kg,每日1次。针刺方法：顺经脉走行斜刺皮下约0.2mm,用均匀手法小幅度捻转1min,留针15min,间歇行针两次(按照中国针灸学会学术部提供的大鼠穴位解剖图谱及比较解剖学取穴)。 2.5取材接种后第15天断颈处死动物,完整仔细地剥离肿瘤结节待测。 3观察指标 3.1小鼠生存状态接种后第5天起,每组动物每日称重,观察动物进食、活动状态及死亡情况,并记录。 3.2肿瘤体积的动态变化接种后第5天起,每日用游标卡尺(精度为0.1mm)测定肿瘤的最长径
5、a和最短径b,按公式V=ab2/2(V为肿瘤体积,a为肿瘤长径,b为肿瘤短径)计算肿瘤体积,统计得出各组肿瘤平均体积,并绘制出生长曲线。 3.3细胞凋亡相关因子p53和Bcl-2蛋白表达的检测电子商务论文发表 3.3.1总蛋白的提取 将肿瘤组织块碾成粉末,加入已预冷的裂解液中,在冰浴中用匀浆机匀浆2min,14000×g,4℃离心1h,取上清于4℃存放备用。3.3.2蛋白定量 用酚试剂法进行蛋白定量。将样品及另一种标准蛋白质(牛血清白蛋白)各取50μL,用双蒸水按1∶10稀释(50μL加450μL水
6、),所有各管均加4mL碱性铜试剂,充分混合,放置20min,加0.5mL1mol/L酚试剂,立即混匀,50℃水浴10min,用紫外分光光度计测样品光密度数值,空白管以蒸馏水调零,记录所测样品光密度数值,计算出蛋白浓度。 3.3.3浓度的调整与样品的处理 把样品调成相同浓度,加入样品buffer,沸水煮5min。 3.3.4SDS-PAGE电泳 配制12%聚丙烯酰胺的分离胶和4%聚丙烯酰胺的浓缩胶；灌制胶板。上样量为50μg,120V继续电泳1.5h,结束电泳,取出凝胶。 3.3.5蛋白质的电转印及
7、膜的封闭 电泳结束后,根据标准蛋白的位置,确定待测蛋白的所在区域,切割硝酸纤维膜。将电泳凝胶与硝酸纤维素膜贴在一起,排出气泡,置膜在正极、凝胶在负极,用湿式转印电泳槽转印,50V,100mA,2h。转印结束后,将膜置入TBS缓冲液中浸泡10min,用含5%脱脂奶粉TBS封闭液封闭后,室温过夜。 3.3.6蛋白质印迹和化学发光显色电子商务论文发表 次日,取出硝酸纤维素膜,用TTBS缓冲液洗2次,每次5min,然后加入兔抗p53、Bcl-2多克隆抗体(1∶400)孵育4h,用TTBS缓冲液洗2次,每次5m
8、in,然后加入碱性磷酸酶偶联的羊抗兔二抗(1∶2000)孵育2h,用TBS洗2次,每次5min,再用TTBS缓冲液洗2次,每次5min,然后加入O–dianidine,β-naphthylacidphosphate显色至条带清晰为止。 3.3.7图像分析 采用自动电泳凝胶成像分析仪(ChmiImager5500,USA)进行图像扫描,并对条带进行密度分析,比较各组p53和Bcl-2蛋白质表达水平。 4结果
