垂体瘤转化基因在垂体细胞衰老和垂体瘤生成中机制的研究

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1、垂体瘤转化在垂体细胞衰老和垂体瘤生成中机制的研究［摘要］目的探讨垂体瘤转化基因(PTTG)在垂体细胞衰老和垂体瘤中表迗规律。方法构建F344大鼠D-半乳糖诱导衰老模型和雌激素诱导泌乳素腺瘤模型。观察大鼠的衰老表型及成瘤情况，对大鼠垂体进行病理学检测，分子生物学方法检测垂体PTTG.P53、P21、P16蛋白表迗。结果①D-半乳糖成功诱导大鼠出现明显衰老特征，雌激素诱导大鼠成功生成泌乳素腺瘤；②衰老大鼠垂体胞质内有空泡和异染色质生成，肿瘤大鼠垂体PRL免疫组化为强阳性；③KT-PCR显示雌激素诱导组PTTGmRNA表达为(12.99±1.86

2、)，D-半乳糖诱导衰老组PTTG表迗为(2.10±0.23)，差异有高度统计学意义(P［Keywords］Pituitarytumortransforminggene；Pituitaryadenoma;Senescence垂体瘤转化基因(pituitarytumortransforminggene,PTTG)是1997年Pei等［1］首次从大鼠垂体瘤组织中发现的新癌基因，PTTG在垂体腺瘤及其他肿瘤中均有较高水平的表达，与肿瘤的侵袭性、转移、血管形成、复发、预后密切相关［2-3］。近期Chesnokova等［4］研究发现垂体细胞内PTTG水

3、平表迗降低和缺失会诱发DNA损伤调控反应(DNAdamagecheckpointresponse,DDR）导致衰老产生，进而阻止肿瘤发生及恶变，说明垂体瘤增殖过程存在衰老。提出癌基因的活化既可以导致肿瘤产生，又可以诱导细胞衰老，称作癌基因诱导细胞衰老（oncogene-inducedsenescence,OIS）[5]o癌基因具有诱导肿瘤衰老和肿瘤增殖恶变的能力，设想通过调控癌基因诱导肿瘤细胞衰老，可以作为治疗肿瘤的新方向。本研究拟通过建立F344大鼠D-半乳糖亚急性衰老模型，同时通过雌激素诱导大鼠泌乳素腺瘤形成，探讨PTTG及衰老通路中相

4、关因子在垂体细胞衰老和垂体瘤生长过程中的表迗，初步阐明癌基因诱导衰老在垂体瘤发生过程中作用机制。1材料与方法1.1实验动物WOg左右4周龄雌性F344大鼠18只[购自北京维通利华实验动物中心，许可证号SCXK（京）2012-0001]。随机分为三组，正常对照组、D-半乳糖诱导衰老组和雌激素诱导垂体瘤组，每组各6只。本研究经牡丹江医学院动物伦理委员会批准，严格按照NIH实验动物伦理原则进行操作。1.2主要试剂及设备彡98%的雌二醇（Sigma公司），彡98%的D-半乳糖（Sigma公司），医用硅胶管（内经2mm，外径3mm,济南晨生医用导管公

5、司），鼠抗鼠单克隆PTTG抗体（abeam公司），鼠抗鼠单克隆P16抗体（abeam公司）OSYBRgreenmasterrox（Roche公司），transcriptorfirststrandcDNASynthesisKit（Roche公司）o1.3构建大鼠衰老模型及垂体泌乳素腺瘤模型10%水合氯醛按0.2mL/100g腹腔注射麻醉，将含有10mgE2无菌硅胶管植入雌激素诱导垂体瘤组大鼠背部皮下，正常对照组及D-半乳糖诱导衰老组植入含有生理盐水的硅胶管。D-半乳糖诱导衰老组于术后7d连续腹腔内注射D-半乳糖200mg/（kg-d）,造成亚

6、急性衰老；正常对照组、雌激素诱导垂体瘤组术后7d腹腔内注射同等量生理盐水对照。观察各组大鼠的精神状态、体重、进食及尿量、肌肉是否有萎缩、毛发光泽度及有无脱毛等。术后第8周，断头处死全部大鼠。解剖垂体，观察垂体形状、大小、质地及颜色，同视神经及颈内动脉比邻关系，观察垂体窝鞍底形状，骨质是否破坏。1.4垂体病理学检测垂体标本常规HE染色，采用S-P法进行免疫组化染色，一抗为大鼠PRL单克隆抗体（murine,Dako公司，美国）。用PBS代替一抗平行染体做阴性对照。1.5RT-PCR检测垂体组织中PTTG、P53、P21、P16mRNA表达PT

7、TG、P53、P21、P16基因的引物由生工生物工程（上海)有限公司合成。按照93°C，3min；95°C，1min,60°C30s,72°C30s,72°C30s,72°C4min；30cycle扩增目的基对每个基因设3-actin做内参，内参基因为Rpsl6o1.6Western-blot检测垂体组织中PTTG、P16、P21表达每组取3只大鼠垂体组织，提取垂体组织总蛋白，进行SDS-PAGE电泳，滴加稀释的Anti-pl6antibody、Anti-p21antibody,Anti-PTTGantibody,DAB显色。照相记录蛋白感

8、光条带用KodakCarestreamMolecularImagine软件测量积分灰度值，以各组蛋白表迗量与3-Action比值进行半定量分析，显示目的基因的蛋白表达水平。1.7