参考教案-蔗糖酶的提取纯化与鉴定

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1、参考教案：酵母蔗糖酶的提取纯化与鉴定蔗糖酶（E.C.3.2.1.26）（卩一D—呋喃果糖苷果糖水解酶），能催化非还原性双糖（蔗糖）的1,2-糖苻键裂解，释放出等量的果糖和葡萄糖。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。由于果糖甜度高，约为蔗糖1.36〜1.60倍，在工业上具有较高的经济价值。可用以转化蔗糖，增加甜味，制造人造蜂蜜，防止高浓度糖浆屮的蔗糖析出，制造含果糖和巧克力的软心糖，还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。蔗糖酶以阿种形式存在于酵母细胞膜的外侧

2、和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶，其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50%糖成分的糖蛋白。在细胞脫内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶，含宥少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比PJ酶多两个氨基酸，Ser和Met,它们的分子量也不同，外酶约为27万（或22万，与酵母的来源有关），内酶约为13.5万。尽管这W种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分和似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取

3、纯化的主要是外酶。每摩尔蔗糖水解产生两摩尔还原糖，蔗糖的裂解速率可以通过NeLson法测定还原糖的产生数量來测定。一个酶活力单位规定为在标准分析条件下每分钟催化底物转化的数量。比活力单位为每毫克蛋白含有酶活力单位。（本实验以酵母为原料）一、教学0的通过酵母菌扩大培养及蔗糖酶的提取纯化与鉴定使学生学会生物大分子（酶）制备方案设计和幵展实践研究的方法，体验从复杂细胞混合物体系中提取纯化酶的基本原理、过程和方法。本实验为学生提供一个较全而的科学研究实践机会，整个实验过程学生独立完成，里然操作难度较大，

4、所需要的实IX!较长（64学吋），但每一步单元操作的原理清晰，技术成熟，实验结果明显，能给学生较多的设计空间和动手机会，有利于培养学生的学习兴趣和从事科学研究的能力。二、教学内容实验设计：包括讲课，答疑，文献综述6学时实验一酵母细胞破碎与蔗糖酶提取条件的选择8学吋实验二蔗糖酶的盐析曲线的制作与沉淀分离8学吋实验三蔗糖酶的有机溶剂沉淀曲线的制作与沉淀分离8学时实验四蔗糖酶的DEAE-纤维素柱层析纯化8学时实验五鹿糖酶的SephadexG-150柱层析纯化8学时实验六蔗糖酶溶液的冷冻干燥2学吋实验七

5、蔗糖酶的纯度分析：聚丙烯酰胺凝胶电泳8$时实验八蔗糖酶的理化性质研究8学时三、实验设计与研究1器材与方法1.1主要单元操作技术与设备1.1.2单元操作技术细胞组织破碎术、离心分离技术、双水相萃取技术、离子交换层析技术、凝胶层析技术、超滤技术、冷冻干燥技术、分光光度技术、电泳技术等生物分离与检测技术；1.1.2主要设备烘箱、恒温摇床、真空干燥箱、分析天平、电子台秤、超声波细胞破碎仪、粉碎机、超滤器(500ml〜5000ml)、冷冻离心机(8000-10000r/min,50mlX6；250mlX6

6、),普通离心机(5000r/min,200mlX4)＞台式离心机(16000r/min,5mlX6)冷冻T燥机、-80度冰箱、制冰机、酸度计、电热恒温水浴锅、匀浆机、蛋白质色谱分离系统(核酸蛋白检测仪、部分收集器、嬌动泉、梯度混合器、10-25mm,h300-700mm层析柱)电泳仪及垂直板电泳槽、脱色摇床、紫外-可见光分光光度计、荧光分光光度计、高效液相色谱、气相色谱、凝胶成像系统、250ml和500ml旋转蒸发仪、微景凯氏定氮仪、常景凯氏定氮仪、500-1000W电炉、超声波清洗器、振动混合

7、器、移夜枪（200-5000ul）、层析缸、电吹风等。1.2.11.2实验材料与试剂5母菌的扩大培养：采用采用实验室经过筛选诱变获得的酵母菌，增殖培养基：葡萄糖5.0g/L、蛋白胨0.5g/L、酵母膏0.5g/L、七水硫酸镁0.lg/L和磷酸二氢钾0.lg/L,调节pH为5.0。发酵培养基：葡萄糖12%〜15%、蛋白胨0.5g/L、酵母膏0.5g/L,七水硫酸镁0.lg/L,磷酸二氢钾0.lg/L和硫酸铵0.5g/L,调节pH为5.0。1.2.2实验试剂甲苯（使用前预冷到O'C以下）；95%乙醇

8、;DEAE-纤维素;SephadexG-150；0.05mol/LTris-HCl缓冲液，pH7.3；十二烷基硫酸钠（SDS）;其余试剂均为国产分析纯。1.2分析方法1.2.1蛋白质浓度的测定：采用Folin法（试剂方法参考生物化学原理和方法）。1.2.2还原糖的测定：釆用DNS法（试剂方法参考生物化学原理和方法）。1.2.3酶活性测定（参考：徐桦，陆珊华，孙爱民.酵母蔗糖酶Km值的测定[J].南京医科大学学报，1999,17(4):329-330)取适当稀释的酶液0.5mL,加入0.3mLpH