westernblot实验方法注意细节2015

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1、WesternBlot实验方法参考以下是根据个人实验总结的方法，所以可能有些步骤和他人具体实验有山入，仅供交流参考。红色标注是重点注意的，易影响后期操作结果的。写了能想到的细节，故看起来较琐碎，不连贯。1.蛋白质变性按比例蛋白中加入载样缓冲液，混匀瞬离。PCR仪95°C7-8min，每孔最大上样量25ul，但超过20ul跑出来的就不好看了，十几ul比较合适；预染marker2.5ul就可以较好显出，建议文章并图加大用量。(以上是我个人实验的用量，之后不在说明。)蛋白加样等操作做建议严格冰上执行。2.配胶建议早上-•来先开始配胶，胶干过程屮再其他操作。10%分离胶(5ml)H2

2、01.9ml3%AB1.7m1.5MTris-HCL(pH8.8)1.3ml10%SDS50ul10%AP50ulTEMED5ul4%浓缩胶(3ml)H2O2.1ml3%AB0.5ml1MTris-HCL(pH6.8)0.38ml10%SDS30ul10%AP50ulTEMED5ul2.1安装玻璃板取山干净、无水的玻璃板，一次性垂直固定在架子上，卡好沿切勿用手再去拨动按压,如此易漏胶。架子水平放置，后期压线平直，具体可专门安置出一块水平地方，单独留于做WB配胶。2.2分离胶配罝制分离胶吋按照配方顺序加样，每加•种摇动混匀，避免后期胶的成分不均匀影响跑样。尤其是AP，TEMED

3、加入后，TEMED主要用于凝胶，其用量决定胶凝固的时间长短，操作时快速。灌胶时可用大枪，固定在玻璃板一侧加，不移动加样。全部加完胶后摇一摇架子，使胶分布均匀，线水平。之后加水压线，加水时枪尽量放水平，缓速边移动边加，如此是为了水均匀压到胶面上，避免同一个地方加水而使胶面难以恢复水平。凝胶时间具体配方、温度不同，我后期用以上配方，40min室温凝胶（5-6月）效果很好，禽方向当吋吋间也差不多如此。个人试过的最长室温凝胶吋间2h，效果和后期用的这种目测无差别。放入烘箱凝胶也是一种加快速度方法，不过要注意压线的水不要蒸干了，也要注意胶凝早期，途中不要在拿出继续室温凝胶，否则易出现两

4、条线。后期剥胶可能后有粘黏，时间配方待改进。2.3浓缩胶配置浓缩胶在剩AP和TEMED未加时，建议此时倒掉玻璃板巾压线的水，成股流下的水用吸水纸吸干。过早倒掉水，会使分离胶表面变干，目测会观察到水平线两侧出现弧度。灌胶方法同分离胶，灌满之后再缓慢插入梳子，操作屮避免气泡浓缩胶凝同时间强烈建议适度延K时间，否则后期洗孔时会有胶仵孔闪，梳子也要选择匹配的，不然无法紧密贴合两侧玻板，使得孔内有•层胶，G期洗孔、加样相当麻烦。我试过凝胶过夜，早上一来立马跑胶，各种配方胶凝的都非常好，孔内很干净，但是跑样的效果与现配胶比略次。浓缩胶现在用的梳子都是一旦插入无法凝胶时补胶，故此孔建议点m

5、arker,量少so无影响。1.装置电泳槽小玻璃板向内，大玻板向外。只跑一板，则对侧用塑料板代替，有字面朝外。装置过程中一定玻璃板使劲下压，同时再扣紧开关固定好玻板，避免后期漏液过快。倒电泳液至A槽满，外槽加电泳液的量尽量少，刚好够可以电泳为止即可（外槽电泳液太少会出现接通电源却没跑，所以等确定电泳上了再离幵）。电泳液尽量新鲜不审.复利用，虽不要求现配现川（如此最好），每次只配1L，保存4°C，34天更换即可，电泳液H接影响跑胶的效果！新鲜的和超过4天的差异极显著。存放时间太长会变粘稠，跑胶跑不动!4•洗孔轻拔梳子，用注射器洗孔，此步骤不能少。5.上样6.电泳浓缩胶80V,分

6、界线处压成线停止，转分离胶100V。具体时间根据自己实验总结，电泳的吋间长短与电泳液的质量也有密切关系。电泳巾途经常查看，及时补加内槽电泳液，保持较高液面差,有利电泳。7.SDS-PAGE建议做WB之前先只做到SDS-PAGE（变性聚丙烯酰胺不联系凝胶电泳）为止，检测蛋白熟悉电泳操作。剥离的胶川考马斯亮蓝250染色过夜，再用纯水加冰醋酸加平醇至水平摇床上漂洗，加热会更快。5.转膜（此处只介绍半干转，理论上适用于小分子蛋白，理论建议120KD以上用湿转。个人实验中的蛋白基本不超过130KD,半干转效果极显著优于湿转）8.1.PVDF膜和滤纸的处理根据转膜面积剪裁好PVDF膜（实

7、验室现用的膜不分正反面），浸泡在甲醇中l-2min激活，后放置在转膜液中备川。滤纸在转膜液中浸泡至饱和备用，面积做到：滤纸2PVDF膜二胶。滤纸可以酌情回收利用，在不污染膜上蛋白的情况下。8.2胶的处理把玻璃板超纯水冲洗干净，剥去浓缩胶。把需要转膜的胶切割下来，短吋间内浸泡在转膜液中平衡，备用。割胶时一次性切下去，避免胶边连带细条胶，后期转膜放胶时操作不方便。8.3制备转膜层总的来说，两片滤纸分别位于最外层，包裹住PVDF膜和胶。膜位于HI极，凝胶位于阴极，蛋白分子带负电荷，故向膜的方向移动。转膜层中贴