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1、WesternBlot实验方法及注意事项实验原理:WesternBlot印迹方法，又称为免疫印记，是将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，对不同分子量的蛋白质进行分离，并通过转移电泳将凝胶上分离到的蛋白质转印至固相支持物(NC膜或PVDF膜)上，用抗靶蛋白的非标记抗体(一抗)与转印后膜上的靶蛋白进行特异性结合，再与经辣根过氧化物酶标记(偶联)的二抗结合，最后用ECL超敏发光液试剂检测。如果转印膜上含有靶蛋白，经X光片曝光、显影后，则会在X-光片上出现特异性蛋白条带。实验材料：分离胶及积层胶溶液、水饱和异丁醇、lXTris•Cl/SDS,pH8.8、蛋白质分子量标准混合物、1XSD
2、S电泳缓冲液、电泳装置及夹子、玻璃板、灌胶支架、缓冲液槽等附件、0.75mm封边垫片、0.75mm样品梳子、50P1微量加样器、恒流电源常用试剂：1)30%丙烯酰胺/0.8%N，N’-亚甲丙烯酰胺将30克丙烯酰胺和0.8克N，N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml水中，加热至37°C溶解之，补加水至终体积为100ml。0.45um微孔滤膜过滤除菌，查证该溶液pH应不大于7.0,置棕色瓶中保存。小心：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和N，N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。2)4XT
3、ris•Cl/SDS,pH8.8,在300mlH20中溶解91gTris碱(1.5mol/L),用lmol/L调节pH至8.8,补加H20至体积500ml。用0.45um滤膜过滤溶液,再加入2gSDS[0,4%(w/v)],于4"C可保存1月。3)4XTris•Cl/SDS,pH6.8,在40mlH20中溶解6.05gTris碱(0.5mol/L),用lmol/L调节pH至6.8,补加H20至体积100ml。用0.45um滤膜过滤溶液，再加入0.4gSDS[O.4%(w/v)],于4°C可保存1月。4)4XSDS电泳缓冲液Trisbase24.2g、Glycerin115.3g>20%SDS
4、20ml加水至总体积1000ml。应用时稀释4倍即为1XSDS电泳缓冲液(Tris0.05M,Glycerin0.38M,SDS0.1%)o1)TEMED(N,N,N’，N’-四甲基乙二胺)TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺的聚合。2)10%过硫酸铵过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和亚甲丙烯酰胺聚合所必需虬自由基。可用去离子水配制小量10%（〜八）虬贮存液并保存于4°C。由于过硫酸铵会缓慢分解，故应隔周新鲜配制。实验步骤：转染后的样品，收毒，12000rpm离心，2min,去上清，细胞碎片就直接进行下面步骤：（1）加入10xRIPAbuffer/每孔200ul
5、,4°裂解30min。（2）准备热变性，用八连管，每孔加入5xloadingbuffer5wl。（3）用20u1移液枪，将裂解后的细胞取出20u1，加入对应的八连管中，并吹打混匀。（4）封口，用PCR仪进行热变性处理：97°8min0（5）4°储存变性后的样品，待检。1、SDS-PAGE凝胶的配制预先配制混合液（Tris-HCL/Acr-bis/SDS/H20），APS以及TEMED在配制凝胶时现加。分离胶：用1.5MTris-HCL8.8、10%分离胶。（所谓的10%浓度为Acr-Bis的浓度，即丙烯酰胺的浓度，用水定容，其他成分不变）；浓缩胶：用lMTirs-HCL6.8,浓度：5%。2
6、、上样电泳：所用梳子为15孔，Marker占用一孔，故每块凝胶可以检测14支样品。上样量：Marker：5U1/孔；样品：20ul/孔；参数：80V,待样品跑出上样孔；120V,样品进入分离胶；200V，直至结束（蓝色指示带到凝胶底部即完成电泳）3、转膜：转膜三明治结构顺序：黑色板、网垫、一层滤纸、凝胶（习惯将Marker放在右侧）、NC膜（在膜的蛋白面左上角做好标记）、两层滤纸、网垫、白色板。备注：所用的滤纸也分粗糙面和细腻面，细腻面对着凝胶和NC膜，粗糙面对着网垫。将三明治结构的夹子放入电极时，黑色板对应电极的黑色一面（负极）、白色版对应电极的红色一面（正极）。强调：凝胶和NC膜（硝化纤
7、维素膜）的顺序千万不要放反，所用的NC膜分粗糙面和光滑面，粗糙面为接受蛋白面，该面和凝胶直接接触。盖槽盖时，同样注意黑色对应黑色、红色对应红色；同样导线电极连接电源的时候，也是黑色对黑色、红色对红色。上述任何一步弄反，都会导致蛋白转膜失败，切记。转膜所用参数：稳流45mA，过夜（999min）。4、封闭所用封闭液：5%Nonfatmilk,用TBST配制，RT（室温），30min〜lh（根据实际情况确定时间，
