Westernblot实验步骤及其注意事项1

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1、I实验步骤及其注意事项（2008-06-1713:27:35）一・实验步骤L组织块称重2.利用液氮、研钵粉碎组织块3.加入缓冲液（每克组织7,MST（每克组织XulMi8/i1MST）,利用进一步匀浆（殴―转/分*1分钟）维持4°C4.加入PKT（每克组织XulMi.'/ilMST），冰上孵育5•分钟5.移入离心管4°C约:'（约转）H分钟•上清液为细胞裂解液可分装・2TC保存T.进行H比色法测定蛋白质浓度9.取相同质量的细胞裂解液（体积诰白质浓度），并加等体积的2X电泳加样缓冲液亂沸水浴中7分钟■・上样IL电泳（浓缩胶分离胶JfciD□・电转膜仪转膜（Ifi

2、i4,分钟）O.膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色14.试剂盒显色K.分析比较记录些sJ0為的实验步骤及注意事项的资料L把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。I）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用《■!■移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。2）在凝胶/滤膜外再包一张51■滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在屮间，保持湿润和没有气泡。"将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。4）将上述装置放入缓冲液槽屮，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。■）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。b）转移结束后，取

3、出薄膜和凝胶，弃去凝胶。2.将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。X用IHi■水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。4.膜置印迹缓冲液中于JTC保温I小时。5.室温下，用WS-叶缓冲液洗涤薄膜。b.用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽对能不留空气。Q袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。■.混合：/CS4IH微升》，印迹缓冲液中的抗体（I•毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4°C过夜）•用总体积3Mi久PBS-y缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次Fi久I••将连接生物素的羊抗兔斗微升溶于I•毫升印迹缓冲液flH微升

4、FCS）加在袋内,于室温下摇动I小时。11.按步骤勺洗涤。12.加入抗生素蛋白■皿（4•微升溶于I•毫升印迹缓冲液/IH微升/CS）,于室温下摇动。注意事项：中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于检测。这种情况对以将表达冃的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行实验中取胶和膜需带手套。中心可以参考如下步骤进行操作。I•收集蛋白样品2］鸟［I亠“》可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的■■及•细胞裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对丁•某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋

5、白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生产的片8%・及A细胞裂解液，可以使用i€ik蛋白浓度测定试剂盒。2.电泳＜DSBS-F^CC凝胶配制gK低凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的5»«低凝胶配制试剂盒。该试剂盒提供了除水和配

6、胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度的配方。样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的S»S-Pii«蛋白上样缓冲液。例如制或的蛋白上样缓冲液。使用副的SBS-KXC蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。黠的gPikCC蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的蛋白上样缓冲液«Ool«rc或沸水浴加热AS分钟，以充分变性蛋白。0＞上样与电泳冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到胶加样孔内即可。为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准。电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压

7、恒压电泳，而在澳酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在t•-IMV高电压可以设置在IMV左右。可以采用普通的电泳仪就可以满足要求,也可以采用碧云天的多功能电泳仪。带定时》。为了电泳方便起见，也可以采用整个gftkcc过程恒压的方式，通常把电压设置在IMV然后设定定时时间为分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。通常电泳时溟酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白己经被适当分离后即可停止电泳。X转膜〜我们推荐在中•■实验中选用W膜。硝酸纤维素膜膜》也对以使用，但

8、硝酸纤维素膜比较脆，扭操作过程中特别是