westernblot配方和方法

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1、WesternBlot配液：1.10%SDS溶液(m/v)：SDS0.1gDDH2O1ml加热溶解，室温保存，用后马上拧紧瓶盖。2.10%过硫酸铵:APS0.1gDDH2O1ml由于过硫胺酸会缓慢分解，最好新鲜配制，或隔周配制（也可每200微升EP分装，4℃保存4W，-20℃保存1月）3.1×电泳缓冲液Trisbase3.028gGlycine14.4gSDS1.0g用蒸馏水溶解至1000ml，调整PH8.3。冰箱内可保存数月。4.10×转膜液（储存液）甘氨酸72.07gTrisbase15.14gDDH2O400ml加水至500ml，储存液不加甲醇，4℃保存。1×转膜液1L配制：10×转膜

2、液储存液100ml，150ml甲醇，加DDH2O750ml，PH8.5，定容至总量1L5.1×转膜液（现配现用）：Trisbase3.03gGlycine14.42g甲醇150ml加水定容至1000ml6.10×TBS：Trisbase12.1gNaCl40g加水，用浓盐酸调整PH至7.6后定容至500ml7.TBST：1×TBS/吐温=1000/18.封闭液：脱脂奶粉2gTBST40ml配胶：先配分离胶，再配积层胶。一般两者同时配制，只是最后分离胶先加TEMED混合后立即灌胶，而积层胶放4℃，等分离胶凝固后再加TEMED混匀后灌胶。（为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，一般加至

3、原来的2-3倍，根据实验当时的温度适当调整）2ml5%积层胶3ml5%积层胶5ml8%分离胶5ml10%分离胶10%两块胶5ml15%分离胶超纯水1.42.12.31.92.851.130％Acr/Bic0.330.4951.31.72.552.51.5mol/LTris·HCl（pH8.8）1.31.30.951.31mol/LTris·HCl（pH6.8）0.250.37510％SDS0.020.030.050.050.0750.0510%APS（过硫胺酸）0.020.030.050.050.0750.05TEMED0.0020.0030.0030.0020.0030.002双丙烯酰胺：

4、丙烯酰胺摩尔比1：29配制时，SDS-PAGE有效分离范围凝胶浓度（％）线性分离范围（KD)1512-431016-687.536-945.057-212按所需分离的蛋白质分子大小选择合适的丙烯酰胺百分比浓度，一般地，5%的凝胶可用于60～200kDa的SDS变性蛋白质分子的分离，10%用于16～70kDa，15%用于12～45kDa。步骤：（1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，用洗洁精将板洗净。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。（2）配胶与上样：先配分离胶，再配积层胶。1、玻璃板对齐后放入制胶架中卡紧（一定要对齐，以免漏胶）。然后垂直卡在夹子上准备配胶。2、按前面方

5、法配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，用枪吸取1ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带下缘以下5mm高度时即可，给积层胶留出足够空间（梳齿长再加1cm）。然后胶上加一层去离子水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要慢，否则胶会被冲变型。）3、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝固（30min）。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上的水，再用去离子水洗涤数次，并用滤纸将水吸干。4、按前面的方法配5％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩

6、胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平（梳子使用前保证干净且干燥）。待到浓缩胶凝固后（室温30min），将凝胶放入电泳槽中，小玻璃板面朝内（若只跑一块胶，则槽的另一边要垫一块塑料板，且有字的一面朝内）。在上下槽内加入电泳液，上槽内的电泳液应没过小玻璃板上缘，下槽内的电泳液应没过金属丝，排除凝胶底部两块玻璃板之间的气泡。加入电泳液后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。5、用电泳液冲洗一下浓缩胶，（目的是去除梳子遗留下的未凝固的丙烯酰胺，以免造成条带变形）可以前一天配胶备用，保鲜膜4度保存，可一周。6、制备样品：测完蛋白浓度后，计算含20—50μg

7、蛋白（根据自己的实验需要进行选择，没有固定的量，一般为40—50ug。）的样品体积即为上样量。取出上样样品至200μl的EP管中，加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×（上样缓冲液与样品蛋白体积之比为1:4）。（上样体积一般在10μl与20μl之间）（其实大一点的垂直电泳槽每孔最大上样量可以达到40μl，胶做得很好的话，50μl问题也不大）上样前要将样品100℃加热5-15min使蛋白变性，立即冰浴，然后低速