westernblot实验方案

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1、WesternBlotting汇报人：赵丽Westernblotting中文名称为免疫印迹，其程序是对经处理的样本（血清、培养细胞和组织匀浆）先进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE),以分离蛋白。然后将电泳后的分离开的蛋白转移至具有结合力的膜上。对印迹膜进行封闭，以防止免疫试剂的非特异性吸附。最后对膜上的蛋白质进行检测。Westernblotting实验简介方法优点SDS-PAGE:高分辨力固相免疫测定：高特异性、敏感性1.方法简便2.标本可长期保存3.结果便于比较WesternBlot基本原理在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转

2、移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。WesternBlotting方法优点：1.快速（一种抗体）2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带缺点：1.免疫反应性降低2.无信号二级放大3.抗体标记费时昂贵,使用不方便一:直接法WesternBlotting方法优点：1.免疫特异性不受标记影响2.信号放大灵敏度高（多个二抗结合位点）3.多种标记的二抗可供选择4.可选择不同的Marker缺点：1.交叉反应引起的非特异性条带2.额外的二抗孵育以及条件优化二、间接法基本流程蛋白的提取倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液每瓶细胞加3

3、ml4℃预冷的PBS（0.01MpH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。按1ml裂解液加10lPMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）每瓶细胞加400l含PMSF的裂解液，于冰上裂解20min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）蛋白的提取每瓶细胞加400l含

4、PMSF的裂解液，于冰上裂解20min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行于4℃下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷）将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于－20℃保存。配10％分离胶加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用枪吸取，胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要

5、沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。配4％的浓缩胶加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外

6、。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板)灌制分离胶隔绝空气ddH2O0.1%SDS:<8%异丁醇：>8%灌制浓缩胶插入梳子加样加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出)StakinggelSeparatinggel电泳采用恒压得方法：1.恒压80V，至样本跑过浓缩胶；2.将电压调至120V至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，准备进行进行转膜。转膜转膜现有两种方法：A.半干转：采用恒流的方法，按照1mA/cm2计

7、算总电流量，时间约为25-60min。（本法多使用NC膜）B.湿转法：采用恒流的方法，横流150mA，1-2小时。（本法多使用PVDF膜，本法会产生大量的热量，且对温度敏感度较高，需用大量冰块降温）转一张膜需准备6张滤纸和1张转印膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。转膜前，转印膜以及滤纸均需浸润在电转液中活化15-20min（其中PVDF膜需在无水甲醇中活化30min后再浸润于电转液中，且滤纸应与胶和膜的大小一致）。将玻板轻轻撬开，将凝胶剪裁后从玻板上移至电转液中。从阴极到正极，按照三层滤纸凝胶转印膜三层滤纸的顺序制成“三明治

8、”（如为湿转，应在三明治的两侧各加一层活化过的海绵，同时应注意去除膜、凝胶和滤纸之间的气泡，且两侧的滤纸不能相搭，避免短路引起转膜不全）。将制好的三明