糖尿病患者血浆中游离氨基酸的代谢组学分析及其与血糖值

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1、致谢本文系国家自然科学基金资助项目（NO90709014）血浆氨基酸代谢谱与糖尿病相关性研究韩晓菲a黄宇虹b王龙星a杨乾栩a肖红斌a*张德芹b*（a中国科学院大连化学物理研究所辽宁大连116023b天津中医药大学天津300193）摘要本文目的是用代谢组学手段研究血浆氨基酸代谢谱与糖尿病相关性。采用邻苯二甲醛（OPA）柱前在线衍生反相高效液相色谱法，建立了血浆中21种氨基酸代谢谱的相对定量分析方法。衍生由自动进样器在线自动完成，紫外检测器检测，流动相A为10mmol/LNa2HPO4-Na2B4O7PH

2、7.95缓冲液，B液为乙腈：甲醇：水(体积比为45:45:10)，二元线性梯度洗脱，流动相B在30min内由5%-46%，27min内21种氨基酸全部得到良好分离。用此方法测定了51位临床糖尿病人血浆氨基酸代谢谱。以相对峰面积作为原始数据，按血糖值高低预分组，通过spss和matlab软件平台，用线性判别分析、逐步判别分析和得分图进行关联研究，结果表明：血浆中氨基酸代谢谱与血糖值的高低存在相关性，对血糖值＜6.2的志愿者和血糖值＞9.5的志愿者，判别分析的总正判率达到了94.1%。逐步判别分析结果表明

3、，有7种氨基酸Arg、Cit、Asp、Asn、Thr、Leu、Trp承载了上述分组的重要信息，其对上述分组的判别分析总正判率为90.2%，可作为反映血糖值高低变化的标志物组，对于糖尿病的早期诊断及深入研究具有潜在的科研及临床价值。关键词氨基酸、高效液相色谱、代谢组学、糖尿病1引言代谢组学作为系统生物学一个新的分支，在疾病诊断[1-2]等方面发挥了越来越重要的作用。真正意义上的代谢组学,其目标是样本中所有代谢组分的确切定性及定量,用所有代谢成分的变化规律来解释整个机体生理状态是最具实际意义的。但严格地讲

4、，目前还没有发展出一种真正代谢组学技术来涵盖所有代谢物而不管分子大小、丰度和性质[3-4]。但我们可以借鉴代谢轮廓谱分析思路，把“整体”代谢物拆分为几“类”，在“类”即轮廓分析层次上进行样本预处理、分析，在分类研究的基础上可以把得到的数据进行整合，同样可以达到尽可能多的解析代谢物，同时又可以避免用同一种预处理和分析技术对不同类代谢产物产生的不兼容现象。总体来看，与生物有机体代谢活动密切相关的代谢产物主要包括：糖类、脂质类、脂肪酸类、核苷类、蛋白质类、氨基酸类等。许国旺等通过代谢靶标分析，以尿中13-1

5、5种核苷类浓度为数据矢量，用主成分分析（PCA）法处理数据，对癌症病人和正常人进行分类研究，识别率达72%[5-6]。梁逸曾等通过对糖尿病患者血浆中脂肪酸轮廓分析，用偏最小二乘-线性判别分析（PLS-LDA）模型进行了糖尿病患者和健康人的模式识别，得到了有价值的生物标记物信息[7]。目前，对氨基酸类代谢谱的代谢组学研究及其与疾病间的相关分析很少。糖尿病是一典型代谢类疾病，其多种并发症是影响患者生活质量的重要因素，对糖尿病早期及超早期发现与预防尤为重要，用代谢组学方法，寻找糖尿病代谢标记物及早期分类诊断

6、方法，已成为糖尿病研究的重要方向之一[8]。氨基酸作为代谢网络中重要的一类代谢物，其与糖尿病间一定也存在相关性，本文目的是通过发展氨基酸类代谢谱的代谢组学方法，来寻找其与糖尿病间是否存在联系。本文建立了血浆氨基酸代谢谱柱前在线衍生化HPLC-UV方法，测定了51位志愿者血浆样本，结合多变量统计分析方法，对以血糖值为预分组指标的分类情况进行了关联分析，结果表明，血浆中20种氨基酸代谢谱与血糖值的高低有很强的相关性，其中有7种氨基酸对血糖值高低分组贡献率最大。2实验部分2.1仪器与试剂1200型高效液相色

7、谱系统，配备可变波长紫外检测器（美国Agilent公司）；氨基酸对照品:天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、天冬酰胺（Asn）、丝氨酸(Ser)、谷氨酰胺（Gln）、组氨酸（His）、甘氨酸（Gly）、苏氨酸（Thr）、精氨酸（Arg）、丙氨酸（Ala）、酪氨酸（Tyr）、缬氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）、亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）、赖氨酸（Lys）、瓜氨酸（Cit）、鸟氨酸（Orn）、牛磺酸（Tau）及内标物正缬氨酸（Norvaline）、邻苯二甲

8、醛（OPA）、3-巯基乙酸，美国ACCOSTANDARD公司生产；乙腈和甲醇为色谱纯；milli-Q超低有机物超纯水机制备超纯水，美国Millipore公司生产。2.2样品采集与预处理51份血浆样本来自天津中医药大学附属医院，血浆样本采集后，立即冷冻保存于-78℃冰箱中。样本数B.S＜6.2为25例，B.S＞9.5为26例。样本在使用前均在室温解冻，精密量取血浆0.5ml，加入冷HClO475μL，内标溶液100μL，涡旋混合震荡1min，离心（1200