血浆氨基酸代谢谱与糖尿病相关性研究论文

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1、血浆氨基酸代谢谱与糖尿病相关性研究论文韩晓菲黄宇虹王龙星杨乾栩肖红斌张德芹【摘要】为了利用代谢组学手段研究血浆氨基酸代谢谱与糖尿病相关性，采用邻苯二甲醛(OPA)柱前在线衍生反相高效液相色谱法，建立了血浆中21种氨基酸代谢谱的相对定量分析方法。衍生由自动进样器在线自动完成，紫外检测器检测，流动相A为10mmol/LNa2HPO4Na2B4O7缓冲液(pH7.95)，B为乙腈甲醇水(45∶45∶10，V/V)，线性梯度洗脱.freelin内由5%增加至46%，27min内21种氨基酸全部得到良好分离。用此方法测定了51位临床糖尿病人血浆氨基酸代谢谱。

2、以相对峰面积作为原始数据，按血糖值高低预分组，通过Spss和Matlab软件平台，用线性判别分析、逐步判别分析和得分图进行关联研究，结果表明：血浆中氨基酸代谢谱与血糖值的高低存在相关性，对血糖值低于6.2的志愿者和血糖值高于9.5的志愿者，判别分析的总正判率达到了94.1%。逐步判别分析结果表明，有7种氨基酸(Arg，Cit，Asp，Asn，Thr，Leu，Trp)承载了上述分组的重要信息。其对上述分组的判别分析总正判率为90.2%，可作为反映血糖值高低变化的标志物组，对于糖尿病的早期诊断及深入研究具有潜在的科研及临床价值。【关键词】氨基酸;高效液相色谱

3、;代谢组学;糖尿病1引言代谢组学作为系统生物学一个新的分支，在疾病诊断1,2等方面发挥着越来越重要的作用。与生物有机体代谢活动密切相关的代谢产物主要包括：糖类、脂质类、脂肪酸类、核苷类、蛋白质类、氨基酸类等。许国旺等通过代谢靶标分析，以尿中13～15种核苷类浓度为数据矢量，用主成分分析(PCA)法处理数据，对癌症病人和正常人进行分类研究，识别率达72%3,4。Yi等通过对糖尿病患者血浆中脂肪酸轮廓分析，用偏最小二乘线性判别分析(PLSLDA)模型进行了糖尿病患者和健康人的模式识别，得到了有价值的生物标记物信息5。目前，对氨基酸类代谢谱的代谢组学研究及

4、其与疾病间的相关分析很少。糖尿病是一种典型代谢类疾病，其多种并发症是影响患者生活质量的重要因素，对糖尿病早期及超早期发现与预防尤为重要。用代谢组学方法，寻找糖尿病代谢标记物并进行早期分类诊断，已成为糖尿病研究的重要方向6。氨基酸作为代谢网络中重要的代谢物，与糖尿病存在相关性。本实验通过氨基酸类代谢谱的代谢组学法其与糖尿病的相关性，建立了血浆氨基酸代谢谱柱前在线衍生化HPLCUV方法，测定了51位志愿者血浆样本，结合多变量统计分析方法，对以血糖值为预分组指标的分类情况进行了关联分析。结果表明，血浆中20种氨基酸代谢谱与血糖值的高低有很强的相关性，其中有7

5、种氨基酸对血糖值高低分组贡献率最大。2实验部分2.1仪器与试剂1200型高效液相色谱系统，配备可变波长紫外检测器(美国Agilent公司)。氨基酸对照品:天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、天冬酰胺(Asn)、丝氨酸(Ser)、谷氨酰胺(Gln)、组氨酸(His)、甘氨酸(Gly)、苏氨酸(Thr)、精氨酸(Arg)、丙氨酸(Ala)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、色氨酸(Trp)、苯丙氨酸(PHe)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、赖氨酸(Lys)、瓜氨酸(Cit)、鸟氨酸(Orn)、牛磺酸(Tau)及内标物正缬氨酸(N

6、orvaline)、邻苯二甲醛(OPA)、3巯基乙酸(美国Accostandard公司);乙腈和甲醇为色谱纯;MilliQ超低有机物超纯水机(美国Millipore公司)制备的超纯水。2.2样品采集与预处理51份血浆样本取自天津中医药大学附属医院，血浆样本采集后，立即冷冻保存于-78℃冰箱中。B.S6.2的样本25例，B.S9.5的样本26例。样本在使用前均在室温解冻，准确移取血浆0.5mL，加入冷HClO475μL，内标溶液100μL，涡旋混合振荡1min，离心15min(12000r/min)，取上清液600μL，加入5mol/L冷NaOH189

7、μL，二次离心5min(12000r/min)，上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，滤液用于氨基酸的分析。2.3在线衍生化方法邻苯二甲醛(OPA)为衍生试剂：移取1mLOPA储备液(10g/L),加入硼酸盐缓冲液(pH10.2)1mL，再加入3巯基乙醇(3MPA)100μL，混匀后，用0.22μm滤膜过滤，待用。衍生化过程在Agilent1200自动进样器上在线自动完成，程序如下：吸取磷酸盐缓冲液(pH10.2)50μL;吸取样品、OPA衍生试剂各5.0μL，充分混合5次，等待1min，进样。2.4色谱条件HypersilC18反相色谱柱(250mm×

8、4.6mm，5μm，大连依利特公司);流动相A为10mmol/LNa2HPO4