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1、负载甘露糖化抗原的DC诱导的特异性杀伤钟国成,徐明,施明,胡美茹,闵敏,陈健【关键词】树突状细胞;,糖基化抗原;,肿瘤免疫 SpecificcytotoxicityofCTLannosylatedantigen [Abstract]AIM:Toinvestigatetheroleofmannosylatedtumorantigeninthecourseofantitumorresponse.METHODS:L2domainofHER2/neu(ErbB2)ectodomainannosylat
2、ed.Dendriticcells(DCs)humanperipheralbloodmononuclearcellbyGMCSFandIL4.ThematurationandfunctionalcapacityofDCspulsedannosylatedL2(mL2)proteinaturation,ulatorymolecules.TheeffectofmL2proteinonDCmaturationoreremarkablethanthatofnonmannosylatedL2protein.
3、Furthermore,DCspulsedL2couldstimulatehightumorcelllysisbyCTL.CONCLUSION:Ourexperimentprovidethefoundationforthestudyofneorvaccinebymannosylation. [Keyannosylatedantigen;tumorimmunity [摘要]目的:探讨甘露糖化肿瘤疫苗在抗肿瘤免疫中的作用。方法:纯化出目的蛋白HER2/neu胞外配体第2结构域（RLD2）,并对其进
4、行糖基化修饰,自外周血单核细胞诱导产生CD83+的DC,利用DC表面的甘露糖受体,使DC负载甘露糖基化的目的抗原mRLD2(mL2),并致敏T淋巴细胞,观察CTL特异性杀伤SKBR3细胞的效果。结果:较之未进行糖基化修饰的目的蛋白RLD2（L2）,mL2能促进DC的成熟,并能诱导出具有更强杀伤效力的CTL。结论:本实验的结果为开展新型甘露糖化肿瘤疫苗的研制提供了理论依据。 [关键词]树突状细胞;糖基化抗原;肿瘤免疫 目前,基于DC的肿瘤疫苗研究是肿瘤免疫治疗研究领域的热点。我们纯化出目的蛋白H
5、ER2/neu胞外配体第2结构域（RLD2）,并对其进行糖基化修饰,然后应用当前普遍采用的rhGMCSF、rhIL4培养体系,自外周血单核细胞诱导产生CD83+的DC,利用DC表面的甘露糖受体可介导高效的抗原内化,使DC负载甘露糖基化的目的抗原mRLD2(mL2),促进DC的成熟,并致敏T淋巴细胞,产生的CTL能特异性杀伤高表达HER2/neu的SKBR3肿瘤细胞。较之未进行糖基化修饰的目的蛋白RLD2（L2）,mL2能促进DC的成熟,并且诱导出具有更强杀伤效力的CTL。 1材料和方法 1.1
6、材料pTIGTrx载体由军事医学科学院生物工程研究所赵志虎博士构建;高表达HER2/neu的人乳腺癌细胞系SKBR3细胞、不表达HER2/neu的人乳腺癌细胞系MDA435细胞,大肠杆菌JM109及BL21(DE3)均由军事医学科学院基础医学研究所分子免疫学实验室保存;含RLD2的原核表达载体GpTIGTrxA/RLD2由徐明硕士构建。DEAESepharoseFastFloacia公司;镍离子亲和层析柱为CLONTECH公司产品;异丙基硫代βD半乳糖苷（IPTG）为Promega公司产品;蛋白质
7、Mr标准品购自上海生物化学研究所;αD甘露吡喃异硫氰酸苯酯为SIGMA公司产品;4甲基吗啉购自Fluka公司;二甲基亚砜购自北京石鹰化工厂ReflexⅢ型质谱仪为德国Bruker公司产品。rhGMCSF、rhIL4购自PeprotechEC公司;RPMI1640完全培养基购自Hyclone公司;优质胎牛血清购自GIBCO公司。FITC标记的抗人CD83（mAb）购自Serotec公司;FITC标记的抗人HLAⅡmAb、FITC标记的抗人CD86mAb购自eBioscience公司;PE标记的抗人C
8、D40mAb购至Diclone公司。淋巴细胞分离液购自天津市川页生化制品有限公司;乳酸脱氢酶试剂盒购自德国Roche公司。 1.2方法 1.2.1目的抗原RLD2的表达、纯化及鉴定参照文献[1]用经鉴定的重组质粒pTIGTrxA/RLD2转化感受态BL21（DE3）,挑取阳性克隆,接种于10mLLB培养基(含100mg/L氨卞青霉素)中,37℃培养过夜。按1∶100比例将工程菌转接于500mL新鲜的LB培养基中,于37℃培养至A600约为05时,加入终浓度为01mmol/L的I
