ad-pten联合pi3k抑制剂对人乳腺癌裸鼠移植瘤的治疗研究

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1、Ad-PTEN联合PI3K抑制剂对人乳腺癌裸鼠移植瘤的治疗研宄祁艳斌1任玉1**时文涛1李国兰1朱之燕1姜锦2梅玫1*(1天津医科大学基础医学研究中心300070;2天津市第一中心医院300192)【摘要】目的木研宄的目的是观察表达PTEN的重组腺病毒(Ad-PTEN)联合PI3K抑制剂LY294002对人乳腺癌细胞株MCF-7裸鼠移植瘤的抑制作用，并初步探讨其作用机制。方法建立MCF-7裸鼠移植瘤动物模型：24只MCF-7细胞株移植成功的裸鼠分为四组，即空病毒载体对照组、DMSO对照组、LY294002用药组、Ad-PTEN与LY294002联合

2、用药组。定期测量裸鼠的体重和肿瘤直径；应用Real-timePCR检测肿瘤细胞中PTEN、PI3K、AKT、NF-KB、CyclingDl、Bcl-2的表达水平。结果相对于对照组和PI3K抑制剂单独用药组，联合用药组对肿瘤生长的抑制作用显著增强(P<0.05),且联合用药组肿瘤组织中PI3K、AKT、NF-KB、CyclingDl、Bcl-2的表达下降(P<0.05),而PTEN的表达升高(P<0.05)◊结论Ad-PTEN与PI3K抑制剂的联合用药可以增强对人乳腺癌细胞株MCF-7裸鼠移植瘤的牛.长抑制作用。【关键词】乳腺癌裸鼠

3、移植瘤模型PI3K抑制剂Ad-PTEN【中图分类号】R730.5【文献标识码】A【文章编号】2095-1752(2012)13-0389-02乳腺癌是发生在乳房腺上皮组织的恶性肿瘤，是女性最常见的恶性肿瘤，其发病率居女性恶性肿瘤首位，死亡率位于第二位，严重威胁着女性的身心健康［1,2］。乳腺癌的发病机制和半.物治疗一直是研究的重点。以往研究显示，PI3K/AKT信号通路与乳腺癌的发生、发展关系密切，参与调控了肿瘤细胞的增殖、转移、侵袭等过程［3］。磷酸酶-张力蛋白(PTEN)是拮抗PI3K/AKT通路及下游信号因子的重要调节蛋白，在乳腺癌中通常低表

4、达。因此，我们想观察联合应用重组腺病毒表达载体Ad-PTEN和PI3K抑制剂LY294002,是否可以更有效的抑制乳腺癌裸鼠移植瘤的增殖，并初步探讨联合用药的作用机制。一、材料与方法(一)实验材料LY294002和二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司；Trizol和逆转录试剂盒购自Invitrogen公司;SYBRgreenreactionmix购自罗氏公司;BALB/c裸鼠购自中国医学科学院肿瘤研究所，小鼠为雌性，周龄3-4周，重15-20g;含PTEN的重组腺病毒由天津市神经病学研究所惠赠；MCF-7细胞系为本实验中心保存；DMEM购自In

5、vitrogen公司，胎牛血清购自杭州四季青公司；Real-timePCR引物由Primer3软件设计，在上海英骏公司合成。(二)实验方法1.细胞培养MCF-7细胞置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，37°C、5%C02培养。2.动物模型建立取处于对数生长期浓度为4×107/mL的MCF-7细胞50μL接种于裸鼠的右鼠鼷部，皮下匀速注入。每隔一周重复接种直至肿瘤形成。待移植瘤长至5.0mm3吋，在无菌条件下取出，修剪去除脂肪和坏死组织，立即放入无血清培养液中，将瘤体剪碎至约l-2mm大小，接种第二批裸鼠左鼷部皮下组织。裸鼠接种

6、完毕大约2周后，瘤体直径增至约5mm吋进行干预治疗。3.动物分组及瘤体变化观察体内动物实验分为：(1)DMSO组：注射与LY294002治疗组等体积的DMSO；(2)空载体组:注射Ad-vector和DMSO各10μL;(3)LY294002组:注射LY294002溶液10μL;(4)联合用药组:Ad-PTEN和LY294002溶液各注射10μL。每组各6只裸鼠。各组瘤组织均采用原位多点注射进行治疗，每隔3天进行一次注射。每隔3天用游标卡尺测量一次肿瘤的长径(a)和宽径(b),肿瘤体积的计算公式为：V=(a×b2)/2

7、o计算各组肿瘤体积的平均值，绘制肿瘤生长曲线。4.Real-TimePCR检测基因表达情况应用Primer3软件，设计扩增PTEN、AKT、PCNA、CyclingDl、Caspase-3、MMP-2、FAK基因特异性引物。液氮研磨后，用Trizol提取肿瘤组织的总RNA。测定RNA浓度，取lμg应用逆转录试剂盒进行cDNA第一链的合成。以cDNA第一链为模板，在ABI7500荧光实吋定量PCR仪上进行扩增。选择GAPDH为内参基因，通过AACt法计算基因表达差异。1.统计学处理应用SPSS13.0软件进行分析。分析方法釆用单因素方差分析；&

8、alpha;=0.05。二、结果(一)对肿瘤增殖的影响联合治疗组皮下肿瘤与空载体对照组、DMSO组和LY294002相比，