质谱 内标等知识

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1、质谱定量的原则内标的选择LC-MS2009-11-0119:44:11阅读178评论2  字号：大中小 订阅<3>质谱定量的原则04——系列讲座内标在做MS定量时应该使用内标。选择一个合适的内标，将能减少因为样品提取、HPLC进样和离子化的多样性造成的差异。在复杂基质的分析中，在SRM积分图上，在标准曲线的低端，常会见到：两个不同的浓度水平，会给出近乎一致的响应。只有当使用一种内标时，这两个点才能被区分。一些研究者试图在实验中不用内标去做标准曲线，但成功率不高。我们在标准曲线上每个浓度水平都重复进

2、样3次。没有内标的情况下，重现性％RSD常常会高于20%；而当使用内标时，%RSD能降低到近2%。我要如何选择一个内标?最好的内标是待定量的化合物的同位素内标。同位素标记的内标将和待测物有相似的回收率、ESI离子化响应，和相似的色谱保留时间。如果你运行的不是临床药代动力学定量，可能很难判断上述说法，因为特殊的合成一个同位素标记的内标，是非常昂贵和耗时的。通常，如果你和一个医学的化学家工作，他们会有一个化合物相似物库，可以被用作内标。这些类似物，在化合物合成中被测试，和该化合物性质相似可以被用户定量

3、内标，而且更重要的是，这些类似物和该化合物的母离子质量有微小的差异。尽量不要使用去甲基化（－14）或者是氧化的（＋16）的类似物作内标，因为待测化合物的母离子常会发生同样的代谢。常见的做内标的类似物是氯代的化合物。氯代的化合物类似物会和待测化合物有相似的色谱保留时间，这是内标的一个重要特性。我们已经发现内标物的一个最重要的特性是它和待测化合物共流出。我该如何使用内标？首先，内标添加需在样品测试方法的开始阶段，典型的，应在血浆crash或固相萃取之前。内标应用同一浓度水平添加（包括标样）。内标应给出

4、可靠的质谱响应。应该注意的是：内标的量应添加得合适，应高于定量限，但不能过高，因为过高的内标响应会抑制被分析物的离子化。“我应该添加多少量的内标？”这是一个重要的问题。通过做一些试分析：早、中、晚的时间点，也许一个或两个标准点，你应该知道你的样品中化合物的大概量。这些信息非常有价值，可以帮助建立一个合适的标准曲线，并知道应添加多少量的内标。举例来说：如果待定量的样品浓度范围是100fg～25pg，检测限是100fg，你应该添加5～10pg的内标。一个好的经验法则是：内标物的量大概是标准工作曲线浓度

5、最高点的1/3。这将给出一个比较不错的响应，并且不会抑制和干扰待测样品的离子化。见图1内标.gif图1内标的量 大规模质谱法简介      目前，研究人员们正在通过各种方法使大规模质谱法变得更有效，而且将这一技术工具缩小化。         大规模质谱法对于药物的发现来说是一个无法比拟的有力工具，而且它在定性与定量分析的应用中有着很大的价值。虽然大规模质谱法的应用能力和敏感性被不断的改进，但是在药物发现研究里面的技术改革只是出现在专门的工具和应用中。这一技术工具的发展有着三大趋势：减少样品处理与准

6、备工作，辅以数据分析，促进可携带性和多功能性。         样品处理        样品处理和准备是质谱技术分析中最耗体力的步骤。通常，要获得一个足够纯度的样品需要两个或更多的分离步骤。市场上的许多仪器通过整合一个化学分离步骤来减少这些劳动量。市场上最新的能大幅减轻劳动量的技术是由日本Shimadzu公司的科学家改进的，这一技术通过机械化样品处理和化学喷墨打印机，被用于直接分析Westernblot实验中的蛋白。Shimadzu科学家用化学打印法在Westernblot薄膜上点上胰岛素来消化蛋

7、白质，然后应用基质溶液和基质辅助激光解吸离子化快速质谱技术（MALDI-TOF）对膜上的样品进行直接质谱分析。       通过以上分析，研究员能够从一次免疫印迹实验中的任意多个点得到蛋白质质谱印记，PMF数据，或整个蛋白质情况。Shimadzu科学家约瑟夫.福克斯博士说：“你能通过一个blot分析做很多事情。可以想像得到，这一技术不仅使药物或小分子化合物的找寻工作得以很好的进行，并且对于生物标记或蛋白质的找寻工作也有同样的作用。”Shimadzu说这一方法的优势在于对于一个蛋白质，其质量的数据能

8、从它最初被识别的blot中提取,并非跑一块新胶切下条带用于质谱分析。探索一块凝胶上的大量难懂的条带需要花费几个月的时间，而这项技术通过从Westernblot中提取PMF数据可以节省时间并且排除人为错误。        自动化、机械化和最小的样品处理也是Shimadzu的新器具LCMS-IT-TOF的主要特点。这一仪器在离子喷入TOF室前通过一个四级杆离子陷阱探测器聚焦于离子，因此有着极高的敏感性。       LC/MS能与一个自动取样器一起进行流水化工作。Shimadzu的HP