清脉饮含药血清对体外tnf

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　　清脉饮含药血清对体外TNF康浩浩1魏齐1魏彦宁1张伟芳2赵凯3*1.宁夏医科大学，宁夏银川750004；2.宁夏医科大学附属回医医院，宁夏吴忠751100；3.宁夏医科大学总医院中医科，宁夏银川750004【摘要】目的：研究清脉饮含药血清对肿瘤坏死因子α（TNF-α）诱导的人脐静脉内皮细胞（Ehay926）的影响。方法：制备含药血清；将体外培养的EAhy-926细胞，随机分为正常对照组、清法组、活血组、全方组、软坚组、西药组、TNF-α损伤组等；清脉饮含药血清与TNF-α共同处理血管内皮细胞24h后，光学显微镜（下称光镜）下观察细胞的形态变化，电子显微镜（下称电镜）下观察细胞的细胞器改变。结果：①光镜下细胞大体形态变化：清脉饮含药血清与TNF-α共同处理的细胞，各组损伤均较少，细胞数量多，活血组细胞数量相对较少；②电镜下细胞结构的改变：清脉饮含药血清与TNF-α共同处理的细胞器损害较单纯TNF-α损伤组的细胞小，其中以中剂清法组、软坚组、西药组对细胞器的损伤最少，细胞的超微结构与正常对照组比较没有明显差异。结论：清脉饮含药血清可一定程度上对TNF-α损伤的血管内皮细胞保护作用，减少其对细胞器的损害，且含药血清对细胞的保护作用存在血清浓度差异，其机制可能与抑制TNF-α的促炎作用以减少其对细胞器的损害有关。.jyqka批号：BCBH2085V，美国Sigma公司）。SD雄性大鼠60只，体重(250±50)g，普通级，由宁夏医科大学动物中心提供［scxk(宁)2013-0035］。1.2药物全方（清脉饮）：垂盆草、大黄、昆布、煅牡蛎、丹参、蒲黄、姜黄、夏枯草、茵陈、泽泻、海藻等；清法组：大黄、垂盆草、夏枯草、昆布等；软坚组：昆布、煅牡蛎、海藻、夏枯草等；活血组：丹参、蒲黄、姜黄、大黄等；以上中药均由宁夏古方大药房提供，各组方药分别按照传统中药煎煮方法，煎煮、滤液，根据大鼠的体重计算用药量后，浓缩至需要浓度［5］，用蒸馏水配制。西药组：辛伐他汀片（批号：110622，山东罗欣药业股份有限公司）10mg/片。2实验方法2.1含药血清的制备 2.1.1分组及给药方法将56只雄性SD大鼠随机分为八组（即正常对照组、低剂量清法方组、中剂量清法方组、高剂量清法方组、全方组、软坚方组、活血组、辛伐他汀组），每组7只。按体型系数换算法［6］中人鼠等效药量换算方法计算给药剂量，全方组16.9g/（kg·d），低剂清法方组2.9g/（kg·d），中剂清法方组5.99g/（kg·d），高剂清法方组12.21g/（kg·d），软坚方组2.61g/（kg·d），活血方组1.7g/（kg·d）（均为生药量），辛伐他汀组0.67mg，给大鼠灌胃，同时以等量生理盐水灌饲正常对照组，每日一次。2.1.2动物采血及分离血清每天灌胃2次，连续3d后，当夜禁食不禁水，第4d再给药一次，中药组在末次给药后1.5~2h，西药组在给药后1h心脏采血；加盖静置2h后，待血液固缩，无菌条件下分离血清，离心（3000r/min，15min）；同组混合用0.22μm的滤器过滤以消除个体差异，再水浴锅灭活（56℃，30min），分装1mlEP管中，-20℃保存备用。2.2TNF-α的溶解及配制①试剂开盖前，将TNF-α冻干粉离心5min，3000~3500r/min；②用无菌水重悬至0.1~1.0mg/ml，用移液枪的枪头轻吹几下，即可使细胞因子完全溶解，不可振荡，将重悬液静置于室温下2h以上；③用含10%胎牛血清的DMEM培养液稀释成20ng/ml，分装，-20℃保存备用。2.3人脐静脉内皮细胞（EAhy-926）培养细胞由上海市中国科学院细胞库提供，用含有10%胎牛血清的DMEM培养基，同时加入100U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素，在37℃，体积分数5%CO2的细胞培养箱中培养细胞；待细胞生长至近汇合状态、铺满瓶壁80%以上时，进行传代；将生长良好的人EAhy-926用0.25%的胰蛋白酶1ml消化1~3min后，轻轻吹打制成细胞悬液，每周传代2~3次；取对数生长期的细胞消化后以1×105/ml，接种于96孔板中培养，待细胞处于增殖期后分组实验。2.4细胞的分组及给药方法取对数生长期的细胞，将其消化，以含10%胎牛血清的DMEM培养液制成细胞悬液以1×105/ml，200μl/孔接种于96孔板或4×105/ml接种于25cm培养瓶中，37℃，5%CO2培养24h，细胞贴壁，近乎融合，吸弃培养液，用含0.2%胎牛血清的DMEM培养液静止24h，使细胞同步化至G1期，然后随机分为9组：正常对照组；TNF-α组；低剂清法组；中剂清法组；高剂清法组；全方组；软坚组；活血组；西药组。加入TNF-α及各浓度含药血清，37℃，5％CO2，培养育24h，待测。2.5实验方法2.5.1光镜观察细胞的大体形态取对数生长期的细胞消化后以1×105/ml制备成细胞悬液，200μl/孔，种于96孔板，待细胞贴壁后，换用含0.2%胎牛血清的DMEM孵育24h，使细胞同步化，同时加入各浓度不同含药血清及TNF-α（20ng/ml）的混合液，200μl/孔，孵育24h后，光镜下观察细胞的大体形态变化［5］。 2.5.2电镜观察细胞超微结构2.5.2.1前固定①取对数生长期的细胞消化后种于25cm2培养瓶中，待细胞贴壁后，换用含0.2%胎牛血清的DMEM孵育24h，使细胞同步化，同时加入各浓度不同含药血清及TNF-α（20ng/ml）的混合液孵育24h，用0.25%胰蛋白酶将其消化，离心800r/min，5min，收集细胞；②加入固定液1ml，重悬，4℃静置10min；③4℃离心800r/min，5min，去上清，尽量除净；④加入固定液1ml，重悬，4℃静置30min；⑤4℃离心r/min，5min，去上清；⑥加入0.1M二甲砷酸钠缓冲液1ml，重悬，4℃静置1h；⑦4℃离心800r/min，5min，去上清；⑧重复操作步骤⑥两次、⑦一次；⑨4℃保存，每周换一次0.1M二甲砷酸钠缓冲液。2.5.2.2后固定①离心800r/min，5min，去上清；②加入1ml1%锇酸，轻混匀，4℃静置1h；③离心800r/min，5min，去上清；④加入1ml0.1M二甲砷酸钠缓冲液，混匀，4℃静置15min；⑤离心800r/min，5min，去上清；⑥重复操作步骤④、⑤。2.5.2.3脱水①依次加入30%、50%、70%冷乙醇，混匀，4℃静置5min，离心800r/min，5min，去上清；②依次加入80%、90%冷乙醇，混匀，室温静置5min，离心800r/min，5min，去上清；③加入100%常温乙醇，混匀，室温静置3min，离心800r/min，5min，去上清；④重复操作步骤③；⑤加入环氧丙烷渗透，室温静置15h，离心800r/min，5min，去上清；⑥重复操作步骤⑤；⑦1∶1不完全包埋液，室温渗透1h。2.5.2.4包埋①离心800r/min，5min，去上清；②将细胞全部转入胶囊中，加入完全包埋液；③离心800r/min，5min，使细胞沉在胶囊底部；④加上标签，35℃温箱6h；⑤42℃温箱6h；⑥60℃温箱6h。2.5.2.4切片观察700及2500倍下观察细胞超微结构的改变。3结果3.1光镜下细胞大体形态变化正常对照组内皮细胞为单层，数量多，饱满，互不重叠，呈铺石状镶嵌排列,边界清楚；TNF-α损伤组细胞数量少，细胞间隙增宽，细胞收缩，胞膜皱缩，细胞边界不清；TNF-α与含药血清共同处理的细胞，各组损伤均较少，细胞数量多，细胞间隙变窄，形态趋于正常，活血组细胞数量相对较少，见图1~4。3.2电镜下细胞结构的改变①体外正常培养的血管内皮细胞，胞膜完整，连续，双层结构，表面可见微绒毛；细胞核圆形或椭圆形，染色质均匀，无固缩；内质网无扩张，线粒体未见肿胀。②TNF-α 损伤组，内皮细胞损伤明显，胞膜破损，不连续，欠完整；核膜双层结构消失，核膜扩张，表面微绒毛减少；细胞核固缩、变形，甚至消失，核内多个核仁，核染色质不均匀、聚集明显；内质网扩张，线粒体肿胀、变性，胞浆内出现大量大小不等的空泡；镜下见大量坏死的细胞碎片及凋亡小体。③TNF-α与含药血清共同处理的内皮细胞，其损害较单纯TNF-α损伤组的细胞小，细胞膜较连续完整；细胞核变形较轻，核染色质较均匀，聚集较少，核仁清晰可见；内质网及线粒体未见明显扩张及肿胀、变性，胞浆内空泡明显缩小或减少；镜下很少见坏死细胞碎片，未见凋亡小体。其中在TNF-α损伤实验同时加入含药血清的全方组、高、中、低剂清法组、软坚组、西药组较损伤组、活血组对细胞器的损伤最少，细胞的超微结构与正常对照组比较没有明显差异（细胞膜较连续完整；细胞核变形较轻，核染色质较均匀，聚集较少，核仁清晰可见；内质网及线粒体未见明显扩张及肿胀、变性，胞浆内空泡明显缩小或减少）。活血组对细胞器的损伤较多，细胞的超微结构损伤较大（内皮细胞损伤较明显，胞膜不连续，欠完整；部分核膜双层结构消失，核膜扩张，表面微绒毛减少；部分细胞核固缩、变形，甚至消失，核内多个核仁，核染色质不均匀、聚集明显；内质网扩张，线粒体肿胀、变性，胞浆内出现少量空泡；镜下可见少量坏死的细胞碎片及凋亡小体）。10%低剂清法组、10%中剂清法组、10%高剂清法三组细胞的超微结构未见明显差异。见图5~22。4讨论ASO属中医“脉痹”、“脱疽”范畴，多认为是由于饮食不节、脏腑亏虚、外邪侵袭导致湿热痰浊瘀血互结，脉络闭阻而成。传统治疗往往采用活血祛瘀消痰之法，各项研究也较集中在活血化瘀领域，较易忽视痰瘀皆为邪气所致，所谓“虚邪贼风”总是疾病之起因，而邪被认为是导致各种脉管病的致病因子。由全国脉管病泰斗奚九一教授提出的“因邪致瘀”理论，首倡以软坚清法为主治疗ASO，疗效满意［7］。赵凯教授在此基础上提出“毒滞脉络”，提出治疗ASO法贵清通［8］，临床运用清脉饮治疗动脉硬化相关疾病取得良好疗效。现代研究表明，在AS的整个发生发展过程中，血管内皮细胞损伤导致的内皮功能障碍不仅是AS的一个始动环节，还是导致其不断进展的重要因素［9］。血管内皮细胞(vascularendothelial cell，VEC)是循环血液与血管平滑肌间的机械屏障，也是人体最大、最重要的内分泌器官。血管内皮细胞在各种刺激下产生促炎因子，在促炎因子作用下引起内皮损伤。因此，在预防和治疗动脉粥样硬化过程中，预防内皮细胞损伤的作用研究显得尤为重要。本研究采用体外培养EAhy-926细胞细胞，探讨清脉饮含药血清对TNF-α诱导的EAhy-926细胞超微结构的影响。TNF-α由活化的巨噬细胞、内皮细胞和平滑肌细胞合成，在细胞因子级联反应中刺激其它细胞因子的合成，并且参与促进黏附分子的表达、炎症细胞的募集和激活，是炎症反应的关键调节因子之一，还可通过影响脂质代谢而促进AS［10-11］。当TNF-α诱导血管内皮细胞损伤后，内皮细胞的损伤又促进白细胞介素-1和TNF-α释放，同时TNF-α对血管内皮细胞再次产生细胞毒作用，进一步导致血管内皮细胞的损伤，从而形成恶性循环［12］。TNF-α是炎症反应的关键调节因子之一，可从多种炎症细胞中释放，在动脉粥样硬化形成和发展过程中起着关键的作用；可抑制一氧化氮合酶的生成、诱导血管内皮细胞凋亡、促进细胞的老化及刺激血管内皮细胞表达粘附分子，导致内皮细胞功能障碍，促使血栓形成［13-14］；并且可以刺激炎症因子的产生，直接发挥促炎作用［13-15］。故在动脉粥样硬化发生发展中TNF-α起着关键的作用［3］。TNF-α是通过对内皮细胞的损伤，促进动脉粥样硬化的发生。因此，抑制TNF-α对内皮细胞的刺激作用，改善和恢复血管内皮功能已经成为AS防治的重要目标之一。实验结果显示，光镜下，TNF-α与含药血清共同处理的细胞，各组损伤均较少，细胞数量多，细胞间隙变窄,形态趋于正常，活血组细胞数量相对较少；电镜下，全方组、高、中、低剂清法组、软坚组、西药组较损伤组、活血组对细胞器的损伤最少，细胞的超微结构与正常对照组比较没有明显差异（细胞膜较连续完整；细胞核变形较轻，核染色质较均匀，聚集较少，核仁清晰可见；内质网及线粒体未见明显扩张及肿胀、变性，胞浆内空泡明显缩小或减少），而活血组对细胞器的损伤较多，细胞的超微结构损伤较大（内皮细胞损伤较明显，胞膜不连续，欠完整；部分核膜双层结构消失，核膜扩张，表面微绒毛减少；部分细胞核固缩、变形，甚至消失，核内多个核仁，核染色质不均匀、聚集明显；内质网扩张，线粒体肿胀、变性，胞浆内出现少量空泡；镜下可见少量坏死的细胞碎片及凋亡小体。）。低剂清法组、中剂清法组、高剂清法三组细胞的超微结构未见明显差异。证实了中医不同治法含药血清对TNF-α损伤的EAhy-926细胞有一定的保护作用，其机制可能与抑制TNF-α炎症反应有关，其可能是治疗动脉粥样硬化的作用机制之一。 .jyqksetF,KariyaB,etal.Aplateletdependentserumfactorthatstimulatestheproliferationofarterialsmoothmusclecellsinvitro［J］.PrNatlAcadSciUSA,1974,71:1207-1210.［2］RossR.Atherosclerosis-aninflammatorydisease［J］.NEnglJMed,1999,31(1):115-126.［3］喻卓,陈鹏,杨桂梅,等.20(R)-人参皂苷Rg3对肿瘤坏死因子-α诱导血管内皮细胞损伤的保护作用［J］.岭南心血管病杂志,2011,17(3):199.［4］OlkkonenV.Oxysterolsandoxysterolbindingproteins:roleinlipidmetabolismandatherosclerosis［J］.AnnMed,2004,36(8):562-572.［5］张伟芳,黄鑫,赵凯.清脉饮及其拆方含药血清对TNF-α损伤的Ealy-926细胞的保护作用［J］.宁夏医科大学学报,2013，6(3):635.［6］陈奇.中药药理实验方法［M］.北京:人民卫生出版社,1994:206.［7］王健,奚九一,赵兆琳.软坚清脉方对肢体动脉硬化性闭塞主证的临床研究［J］.中国中西医结合外科杂志,2004,10(2):67.［8］陈凯伟,钱月慧,黄鑫,等,清脉饮及其拆方对动脉粥样硬化闭塞症兔主动脉I-kB及NF-kBmRNA表达的变化的影响［J］.宁夏医科大学学报,2014，7(3):720.［9］缪薇,朱榆红.动脉粥样硬化发病机制和药物干预的研究现状［J］.临床医学,2009,16(3):401.［10］居峰,吴剑,吴文宏,等.高甘油三酯血清对人脐静脉内皮细胞的损伤作用［J］.实验与研究,2011,8(12):27.［11］金惠铭,刘清行,曹翔，等.TNF-α引起的微血管内皮细胞功能障碍及其细胞分子机制［J］.微循环学杂志,2000，10(3):5.［12］林蓉,刘俊田,甘伟杰.槲皮素TNF-α损伤的血管内皮细胞的保护作用［J］.中药材,2004,27(8):598.［13］KleemannR,ZadelaarS,KooistraT.Cytokinesandatherosclerosis:aprehensiverevieice［J］.CardiovascRes,2008,79(3):360-376.［14］ZhangH,ParkY,G,vanRielPL,etal.TheroleofTNFalphainchronicinflammatoryconditions,intermediarymetabolismandcardiovascularrisk［J］.JLipidRes,2007,48(4):751-762.(收稿日期：2014.12.10)