可溶性tat ptd

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1、可溶性TATPTD：周国钰，胡学强，胡骏，陆正齐，楼之茵，朱灿胜，熊洁萍【摘要】【目的】构建含蛋白转导域(proteintransductiondomain,PTD)与脑红蛋白(neuroglobin,Ngb)融合基因的表达质粒，原核表达可溶性TATPTD-Ngb，并鉴定、纯化，检测TATPTD-Ngb对皮质神经元的跨膜转导功能。【方法】提取SD大鼠脑组织总RNA，通过RT-PCR法构建编码TATPTD-Ngb的融合基因，克隆入pET28b原核表达载体，转化入大肠杆菌BL21（DE3）pLysS，诱导表达，表达产物进行SDS-PAGE、D19-

2、Tsimple载体购自大连宝生物工程公司；大肠杆菌DH5α由本校药理学教研室胡骏博士赠送。1.1.2试剂　Trizol试剂购自Invitrogen公司；合成cDNA第一链的逆转录试剂盒购自Fermentas公司；TaqDNA聚合、T4DNA连接酶和各种限制性内切酶购于大连宝生物工程公司；X-gal、IPTG购于AMRESCO公司；质粒抽提试剂盒、胶回收纯化试剂及Ni-NTA蛋白亲和纯化琼脂购于QIAGEN公司；抗His-Tag小鼠单克隆抗体购于TIAGEN公司，羊抗小鼠二抗购于武汉博士德生物技术有限公司；氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素均为SIGM

3、A分装；ECL试剂购自PIERCE公司；Neurobasal培养基及B27购自Gibco公司。其余常规试剂均为进口或国产分析纯。1.1.3PCR引物　根据Genbank中大鼠Ngb和TAT-PTD基因序列设计了两条引物，即在Ngb成熟肽基因序列的5′端融合了含有PTD基因序列，由上海生工生物技术有限公司合成。上游引物：5′CATATGAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGAGCTAGCATGGAGCGCCTAGAGTCAGAGCT3′（含NdeⅠ、NheⅠ酶切位点）；下游引物：5′GAGCTCTACTCCCCGTCCCAGCCTC

4、G3′（含SacⅠ酶切位点）。扩增产物片段500bp。1.1.4实验动物　SD乳鼠由中山大学实验动物中心提供。１.2　TATPTD-Ngb基因的克隆1.2.1RT-PCR扩增TATPTD-Ngb基因取SD乳鼠脑组织用Trizol试剂提取脑组织总RNA，按逆转录试剂盒说明合成cDNA第一条链，取2μＬ逆转录产物进行PCR，反应条件如下：94℃预变性5min，94℃30s、68℃40s、72℃1min，循环30次，72℃延伸10min。PCR产物进行0.15g/L琼脂糖电泳分析，并对目标条带切胶回收。1.2.2PCR产物的克隆与测序　PCR产物经胶

5、回收纯化后与pMD19-Tsimple载体用T4DNA连接酶16℃连接2h，转化DH5α感受态，涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，菌落经蓝白班筛选，抽提质粒经NdeⅠ/NheⅠ限制性内切酶双酶切鉴定，选取含目标片段的单克隆菌落并送上海英骏生物技术有限公司测序。1.2.3TATPTD-Ngb表达质粒的构建用NdeⅠ/NheⅠ限制性内切酶从阳性TA克隆载体上切下TATPTD-Ngb基因序列并胶回收，与同样酶切的含His-tag的pET28b表达载体16℃连接反应2h，构建表达质粒pET-TATPTD-Ngb，简称pETPN，转化大肠杆菌DH5α感受态

6、，涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB平板上，挑选菌落、质粒抽提并经酶切鉴定筛选阳性单克隆，送上海英骏生物技术有限公司测序。1.3TATPTD-Ngb融合蛋白的表达、纯化与鉴定1.3.1TATPTD-Ngb融合蛋白的表达及可溶性分析经酶切鉴定的pETPN质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）plysS感受态，形成稳定的高表达细菌株，在含50μg/ml卡那霉素的LB平板上划单菌落，挑取单菌落接种于5mlLB培养液中(含卡那霉素50μg/mL，氯霉素37μg/mL)，37℃200r/min振摇过夜；次日按1∶100的比例接种至10mL上述LB培养液中，

7、37℃200r/min振摇，培养约2～3h，A值至0.6左右，加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG，37℃200r/min诱导表达0，1，2，4，6，8h，离心收集细菌沉淀，按10∶1的比例的加入20mmol/LTris·Cl溶液，超声破碎细菌，SDS-PAGE电泳分析蛋白表达情况。取诱导表达8h的细菌沉淀超声破碎产物4℃下15000×g离心30min，分别收集上清和沉淀，加入SDS-PAGE电泳上样缓冲液，检测上清和沉淀中TATPTD-Ngb融合蛋白的表达。1.3.2TATPTD-Ngb融合蛋白的gP2+的解剖液洗涤后离心去上清，加入含2

8、mL/LB27的Neurobasal培养基内，以0.5×106/mL的密度种植在用多聚赖氨酸包被好的培养皿中35mm培养皿（2mL/皿）中，置于含体积