高浓度腺苷通过抑制细胞增殖促进细胞存活

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1、高浓度腺苷通过抑制细胞增殖促进细胞存活　　[Abstract]Objective:Tostudytheinfluenceofincreasedconcentrationofadenosineoncellsunderenvironmentalcrisis.Methods:Highconcentrationofadenosineulateenvironmentalcrisis,andthecellproliferation,cellcycleandsurvivalofcellsined.Results:Adenos

2、ineinhibitedcellproliferationbutdidnotinducecellapoptosis.Adenosineinhibitedcellcycleandpromotedcellsurvivalundernoglucosecondition.Conclusion:Highconcentrationofadenosinepromotescellsurvivalbyinhibitingcellproliferation.　　[Keyaaldrich公司。　　1.2显微镜观察细胞密度　　将对数

3、生长期HEK293T细胞以(1～2)×104每孔接种于24孔板。置37℃、体积分数为0.05的CO2细胞培养箱中培养过夜后进行腺苷处理。腺苷处理前及处理24h后分别在显微镜下拍照。　　1.3MTT法测细胞活力　　在24孔板里按每孔(1～2)×104个细胞接种400μl细胞悬液,置37℃、体积分数为0.05的CO2细胞培养箱中孵育过夜，进行药物处理24h或48h后;每孔加入40μlMTT溶液(5mg·ml-1)，37℃反应4h;小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入100μl二甲亚砜(DMSO)，室温孵育10min;

4、振荡后通过酶标仪测定各孔在570nm的光吸收值，参比波长为690nm，对每孔的光吸收值进行定量测定,每组设定3复孔。　　1.4PI法测定细胞周期　　胰酶消化细胞后，用含血清的培养基终止消化，离心收集细胞;然后用预冷的PBS洗涤细胞，弃上清，用100μlPBS悬浮细胞;冷的体积分数为0.75的酒精1ml滴加固定细胞(边振荡，边滴加);4℃固定过夜;2000r·min-1离心3min;弃上清，PBS洗涤;2000r·min-1离心3min;1×RNase(10～15μg·ml-1)，消化15min;PI染色10mi

5、n，利用流式细胞仪检测分析细胞周期。　　1.5细胞凋亡检测　　收集细胞，PBS洗涤细胞，离心弃上清;用结合缓冲液洗涤细胞，离心弃上清，400μl结合缓冲液悬浮细胞;加AnnexinVEGFP，冰上避光20min;每管加1μlPI(500μg·ml-1)，10min后利用流式细胞仪检测细胞凋亡。　　2结果　　2.1高浓度腺苷抑制细胞增殖但不诱导细胞凋亡　　通过观察细胞密度可以看到，加入高浓度腺苷后，HEK293T细胞密度明显降低(图1A);MTT实验结果显示腺苷处理HEK293T细胞24或48h后，HEK

6、293T细胞活力随着腺苷浓度的上升逐渐降低(图1B);说明高浓度腺苷可以抑制细胞的增殖(图1B);流式细胞仪检测细胞凋亡显示高浓度腺苷处理细胞24h并没有显著诱导细胞凋亡(图1C)。　　2.2高浓度腺苷通过抑制细胞周期从而抑制细胞增殖　　细胞通过细胞周期而不断地自我增殖，我们利用流式细胞术检测腺苷是否通过抑制细胞周期的进行从而抑制细胞增殖。结果显示，高浓度腺苷明显改变HEK293T细胞周期的进程，导致G0/G1期和G2/M期细胞明显增多，呈阻滞现象(图2)。说明腺苷通过抑制细胞周期的进行从而抑制了细胞的增殖。

7、腺苷可以通过细胞膜上的转运载体蛋白运输进入细胞质内发挥作用[4-5]，也可以通过与细胞膜受体结合发挥生物学功能[6-7]。我们通过向细胞培养物加入腺苷转运蛋白抑制剂发现，加入转运载体蛋白抑制剂缓解了腺苷对细胞的抑制作用，说明腺苷需要通过转运载体蛋白进入细胞内发挥其抑制细胞周期的作用(数据未公开)。　　A.腺苷抑制细胞增殖的细胞形态图;B.MTT法测定细胞活力(纵坐标为加药后的细胞活力占对照组细胞活力的比值);C.用1mmol·L-1腺苷处理HEK293T细胞24h,无凋亡细胞图1腺苷抑制细胞增殖　　A.Cel

8、lmorphologyofHEK293Tafteradenosinetreatmentfor24h;B.MTTassayofHEK293Tafteradenosinetreatment(Yaxisrepresentstheratioofproliferatingactivityofcellstreatedentmol·L-1concentrationofadenosine　　2.3