肺癌外周血中egfr mrna、sp

《肺癌外周血中egfr mrna、sp》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、肺癌外周血中EGFRmRNA、SP：仲崇俊，蒋庚西，陶国华，王永旺【摘要】目的：应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测肺癌患者肿瘤组织和外周血中EGFRmRNA、SP-DmRNA、LUNXmRNA的表达，探讨其作为肺癌微转移检测分子标志物的可行性。方法：应用RT-PCR技术检测40例非小细胞肺癌组织和15例肺良性病变组织中EGFRmRNA、SP-DmRNA、LUNXmRNA的表达；检测40例肺癌患者外周血中靶基因的表达，并以15例良性肺疾病患者和10名健康人外周血作为对照。结果：40例肺癌患者病理组织中EGFRmRNA、SP-DmRNA

2、、LUNXmRNA的表达率为77.5%（31/40）、100%（40/40）、100%（40/40），外周血中EGFRmRNA、SP-DmRNA、LUNXmRNA表达阳性率分别为55.0%（22/40）、52.5%（21/40）和57.5%（23/40）；对照组中15例肺良性病变患者病理组织中EGFRmRNA表达率为13.3%（2/15），无SP-DmRNA和LUNXmRNA表达，15例肺良性病变患者和10名健康人的外周血中无EGFRmRNA、SP-DmRNA、LUNXmRNA表达。结论：EGFRmRNA、SP-DmRNA、LUNXmRNA作为

3、检测肺癌组织及肺癌外周血微转移的分子标志物具有良好的敏感度和特异性；三者表达与肺癌TNM分期、组织学类型和癌细胞分化程度关系密切。【关键词】肺肿瘤；微转移；表皮生长因子受体；肺表面活性蛋白D；肺特异性蛋白X　肺癌细胞在术前、术中脱离原发灶，以非常少的数量转移到淋巴结、血液、骨髓或远处器官中，常规临床检查难以发现，此为肿瘤的微转移。RT-PCR技术的发展，使检测外周血中微量癌细胞成为可能。但目前在肺癌微转移的检测中，缺少公认的特异的分子标记物[1]。本实验采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测了40例非小细胞肺癌（NSCLC）患者外周血中

4、EGFR、SP-D和LUNX的表达，分析其与病理生理学特征的关系，以探讨靶基因作为诊断肺癌微转移的价值。　　1材料和方法　　1.1一般资料病例40例NSCLC患者均于本院胸心外科手术患者，病理学诊断明确，且临床影像学检查未见远处转移，其中，≥55岁31例，＜55岁9例，男30例，女10例，腺癌22例，鳞癌18例；另选15例肺部良性疾病患者（包括良性肿瘤、肺大泡、支气管扩张等）及10名健康人作为对照组。　　1.2试剂与引物设计参照GenBank，采用PrimerPremier5引物设计软件设计EGFR、SP-D和LUNX基因内外引物，EGFR上游

5、:5'-CATCTCCGAAAGCCAACA-3'，EGFR下游:5'-CGACGGTCCTCCAAGTAG-3'，扩增产物长度244bp；SPD上游:5'-AAAGTGTCGGGGAGAAGA-3'，SPD下游:5'-TCAGTCATGCTCAGGAAA-3'，扩增产物长度178bp；LUNX上游:5'-GGGCATTCTGGAAAACCT-3'，LUNX下游:5'-GGCGTATTCACTTGGAGC-3'，扩增产物长度237bp；内参引物为GAPDH（3-磷酸甘油醛脱氢酶）以检测RNA的完整性，GAPDH上游:5’-CGGAGTCAACG

6、GATTGGTCGTAT-3'，GAPDH下游:AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3'，扩增产物长度306bp，由上海生工合成。　　1.3标本的收集与总RNA抽提对所有肺癌患者于治疗前抽取新鲜肝素抗凝血5ml，用淋巴细胞分离液进行有核细胞的分离，Trizol试剂一步法抽提总RNA，另对手术切除肿瘤于手术室内切取小块新鲜肿瘤组织液氮速冻保存，取约50~100mg行总RNA的抽提。　　1.4RNA鉴定对所抽提的总RNA行紫外分光光度定量，并行1%琼脂糖凝胶电泳观察。cDNA第一链合成取样品总RNA约2μg加入20μl反应体系中，按照

7、试剂盒提供的条件进行逆转录。　　PCR扩增EGFRmRNA、SP-DmRNA、LUNXmRNA与GAPDH(内参)。按照文献报道方法[4~6]，结合实验优化条件进行。具体反应条件分列如下：EGFR、SP-D、LUNXPCR反应体系25μl，其中cDNA2μl,10×PCRbuffer2.5μl,TaqDNA5U/μl聚合酶0.2μl,2mmol/LdNTPmix2.5μl,20mmol/LMgCl21.5μl,EGFR上、下游引物(10pm/L)各1μl,加入适量的双蒸水，使总体积达25μl。反应条件:95°C预变性5min,95°C变性45s

8、，50°C45s，72°C45s，共45个循环，在第15个循环末时加入GAPDH上、下游引物(10pmol/L)各1μl，最后72°C延伸7min。P