ELISA夹心法定量检测rhGM-CSFIL-3融合蛋白方法的建立.doc

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1、ELISA夹心法定量检测rhGM-CSFIL-3融合蛋白方法的建立作者：袁淑云蔡宗友饶颖竹肖桂元【关键词】ELISA夹心【摘要】目的建立一种快速灵敏的定量测定rhGM-CSF/IL-3融合蛋白的方法。方法采用ELISA双抗体夹心法。结果当rhGM-CSF/IL-3浓度在0.49～6.25ng/ml时呈线性关系，回归系数为r=0.995，建立的方法与各种血液组份和细胞因子无交叉反应，灵敏度49pg/ml，批内变异系数为5.96%，批间变异系数为7.08%。结论该法检测速度快，重复性好，灵敏度高，特异性好。关键词rhGM-CSF/IL-3融合蛋

2、白ELISA法本文对大肠杆菌表达的重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子/白细胞介素-3（rhGM-CSF/IL-3）融合蛋白进行了中试纯化研究，进一步的研究表明rhGM-CSF/IL-3体外能促造血祖细胞的生长发育，具有较好的开发应用前景。为了进一步研究其在体内的药效以及药代动力，必须对其进行定量测定。但目前尚无一简便有效的检测方法对rhGM-CSF/IL-3进行定量检测。基于rhGM-CSF/IL-3的免疫特性，本文建立了ELISA夹心法［1］定量检测rhGM-CSF/IL-3。1材料与方法1.1主要试剂鼠抗剂rhGM-CSF单克隆抗体（r

3、hGM-CSFMcAb）为自制;鼠抗rhGM-CSF多克隆抗体（rhGM-CSFPcAb）、兔抗rhIL-3多克隆抗体（rhIL-3PcAb）、酶标记羊抗兔IgG（购自Amcrsham公司）;LPS、HRP、BSA（购自SIGˉMA公司）;G-CSF、rhGM-CSF、EPO（购自Amgen公司）;IL-2（购自Cetus公司）;rhGM-CSF、IFN-α（购自Schering-Plough公司）。1.2ELISA夹心法测定rhGM-CSF/IL-3融合蛋白用250mmol/L磷酸盐缓冲液（PBSpH8.0）按适当比例稀释的rhGM-CS

4、FMcAb100μl包被微孔板，20℃16h，将A液（0.1%Tween-20的PBS）洗板5次，加200μl1%BSA-PBS溶液20℃封闭6h，A液洗板，甩干，-20℃保存备用。使用时解冻，每孔加样本100μl，4℃16h;A液洗板5次，加B液（0.1%Tweem-20，0.1%BSAin50mmol/LPBS，pH7.3）适当稀释的rhIL-3PcAb100μl1h;A液洗板5次，加100μlHRP-羊抗兔IgG，37℃1h;A液洗板，加100μlOPD显色液（1mg/ml邻苯二胺，0.012%H2O2，100mmol/L柠檬酸-磷酸

5、缓冲液，pH5.0），30min后用2mol/LH2SO4100μl终止反应，用酶标仪检测OD490nm值。1.3矩阵法选择包被第一抗体与桥联抗体量用棋盘测定法确定各抗体最适浓度，选择rhGM-CSFMcAb浓度为1、5、10、15μg/ml，rhIL-3PcAb稀释度为1:10、1:100、1:1000稀释时，分别测定OD490nm值，以其OD490nm值稳定时，低浓度值为最佳浓度。2结果2.1测定条件的优化用棋盘测定法测定5ng/ml的rhGM-CSF/IL-3，表明hGM-CSFMcAb的最佳浓度为10μg/ml，rhIL-3PcAb

6、的最佳稀释度为1:100。100μl可以产生足够陡的剂量反应曲线，且本底低，是最佳反应体积。测定最低检测浓度至少需要显色30min。2.2特异性和灵敏度2用建立的ELISA法测定血清主要组份和细胞因子的干扰性，表明LPS（100μg/ml）、BSA（10μg/ml）、G-CSF（2μg/ml）、EPO（0.1μg/ml）、IL-2（0.08μg/ml）、rhGM-CSF（2μg/ml）、IFN-α（0.5μg/ml）、rhIL-3（2μg/ml）与正常人血清rhGM-CSF/IL-3无交叉反应性。见表1。典型rhGM-CSF/IL-3标准剂

7、量反应曲线表明该法最低检测浓度为50pg/ml。2.3回收率将已知量标准rhGM-CSF/IL-3用已经建立的方法测定，回收率为92%～108%。2.4批内变异与批间变异测定了低、中、高三个浓度的批内变异，变异系数为5.96%（0.654±0.039，n=10）;批间变异测定在不同日期进行，批间变异系数为7.08%（0.678±0.048，n=5），低浓度样品变异系数稍大。3讨论GM-CSF与IL-3是功能性相关的糖蛋白家族成员，对红细胞系统，嗜中性、嗜碱性、嗜酸性粒细胞、巨核细胞和单核/巨噬细胞系在刺激细胞生存、增殖与分化上有交叠（ove

8、rlap）作用［2］。GM-CSF与IL-3在体外对鼠和恒河猴刺激造血有协同作用，二者已开始用于临床，但同时使用副作用较大，美国已通过基因工程在酵母中表达出一种称为PIXY321