Ecoli和Yeast菌体蛋白ELISA定量测定方法的建立.doc

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1、Ecoli和Yeast菌体蛋白ELISA定量测定方法的建立【关键词】,菌体蛋白；酶联免疫吸附测定；紫外线辐照；葡萄球菌A蛋白；生物素　　［摘要］目的：提高酶联免疫吸附测定（ELISA）方法的灵敏度。方法：将聚苯乙烯微孔板（PS）经过紫外线（UV）辐照后，用葡萄球菌A蛋白（SPA）预包被，再应用生物素链霉亲和素（BSA）反应建立双抗体夹心ELISA。结果：检测低限为1.95ng/ml,方法的批内变异分别为7.96%和8.63%。结论：为菌体蛋白的测定提供了一种新的方法。　　［关键词］菌体蛋白；酶联免疫吸附测定；紫外线辐照；葡萄球菌A蛋白；生物素链霉亲和素　　Establishment

2、ofELISAfortheQuantitativeDetectionofEcoliandYeast　　Absract：ObjectiveImprovethedetectivesensitivityofenzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA)method.MethodsPrecoatingstaphylococcalproteinA(SPA)onUVirradiatedPSplate,thenapplyingbiotinStreptavidinsystemtoestablishakindofsandwichELISAmethod.ResultsThe

3、detectablelowerlimitis1.95ng/ml,thewithinrunCVare7.96%and8.63%.　　Keywords：Bacterioprotein;ELISA;UAirradiation;SPA;BiotinStreptavidin　　酶免疫测定（enzymeimmunoassay,EIA)是将酶促反应的高效率与免疫反应的高度专一性有机地结合起来，可对生物种体内各种微生物分子（抗原/或抗体）进行定性或定量分析，广泛应用于生物科学和医学实验诊断领域［1］。大肠杆菌（Ecoli)和酵母菌（Yeast)分别为原核和真核细胞微生物，具有代表性，为了提高对微生

4、物分子检测的灵敏度，我们在改善固相模式的基础上，利用生物素链霉亲和素（BSA）放大系统，建立了检测菌体蛋白的ELISA方法。　　1　材料与方法　　1.1　主要试剂与仪器　　　　　　　　　大肠杆菌（Ecoli)、酵母菌（Yeast)菌体蛋白（浓度均为104mg/ml),由上海万兴生物制品公司提供；多克隆兔抗Ecoli、兔抗Yeast、山羊抗Ecoli和山羊抗Yeast、辣根过氧化物酶标记的羊抗Ecoli(HRPGAEcoli)和羊抗Yeast(HRPGAYeast)由南京军区南京总医院提供；生物素N羟基琥珀酰亚胺酯（BNHS）由美国Sigma公司生产，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（

5、StreptavidinHRP)(编号BA1088）购自博士德生物工程有限公司，葡萄球菌A蛋白（SPA）购自上海生物制品研究所，其他所用化学试剂均为国产分析纯。BIORADModel550酶标仪。　　1.2　山羊抗EColi和山羊抗YeastIgG组分的纯化　　　　　　　　　采用50%饱和硫酸铵盐析法提取［2］，生理盐水溶解后用pH7.40.01mol/L磷酸盐（PBS）缓冲液透析，定蛋白量备用。　　1.3　生物素标记山羊抗Ecoli和山羊抗Yeast［3］　　　　　　　　　将上述纯化的山羊抗Ecoli和山羊抗Yeast用pH8.80.1mol/L硼酸缓冲液透析，用无水DMSO配制

6、10mg/ml生物素N羟基琥珀酰亚胺酯溶液，按照75μg/ml的氯化铵（用pH7.40.01mol/LPBS配制），室温孵育10min，完毕后用PBS透析，并加入适量的中性甘油于-20℃低温冷冻保存，其工作浓度用方阵滴定法进行确定。　　1．4　Ecoli和Yeast菌体蛋白检测实验条件　　　　　　　　　包被液：pH9．60．05mol／L碳酸盐缓冲液；洗涤液：pH7．40．01mol／LPBSTween20；稀释液：10％小牛血清(用pH7．40．01mol／LPBS配制)。用方阵滴定法摸索固相分子SPA的最适包被浓度和兔抗Ecoli与兔抗Yeast抗体的最适反应浓度。先用SPA分

7、子预包被，再分别与兔抗Ecoli、兔抗Yeast反应而固相至微孔板表面，采用上述稀释液进行封闭，至此即可用菌体蛋白的测试。具体步骤如下：将一系列标准浓度的菌体蛋白分别加入到包被好的微孔板内，每孔100μl，于37℃反应1h，洗涤，空干后分别加入其相应的生物素标记山羊抗Ecoli和Yeast抗体(BiotinGAEcoli和BiotinGAYeast，工作浓度预先摸索)，每孔100μl，37℃反应1h，洗涤，加入StreptavidinHRP，每孔100μl，37℃反应