α-淀粉酶菌株摇瓶发酵初筛及酶活力测定

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1、α-淀粉酶菌株摇瓶发酵初筛及酶活力测定目的要求了解利用微生物摇瓶发酵初筛的目的。了解发酵用培养基的配制要求。掌握碘比色法（部颁标准）测定α-淀粉酶活力的原理和方法步骤。发酵培养基（100mL装于500mL三角瓶）可溶性淀粉8g；豆粕粉4g；Na2HPO4.12H2O0.8g；（NH4）2SO40.4g；CaCl20.2gNH4Cl0.15g；CaCO30.15g水100mL121.3℃灭菌20分钟发酵培养基配制说明三角瓶规格要统一。先将不溶解的可溶性淀粉、豆粕粉、CaCO3分别称于500mL三角瓶。将无机盐称量后先溶解于水中，调节pH

2、为7.0~7.5，再用量筒量取100mL加于三角瓶中，轻摇混匀。121.3℃灭菌20分钟灭完菌后取出，要马上轻摇混匀（？）。种子培养基（下周使用）可溶性淀粉3g；Na2HPO4.12H2O0.4g；（NH4）2SO40.2g；CaCl20.2gNH4Cl0.15g；4%豆粕粉浸出液100mL煮沸使淀粉溶解后，取50mL分装于250mL三角瓶（2瓶）包扎；取5mL分装于18×180mm试管中（5支），加塞包扎。121.3℃灭菌20分钟其它器材1mL无菌吸管10支2mL无菌吸管5支相关碘液的配制碘原液：称取碘11g，碘化钾22g，置于小烧杯

3、中，加10ml蒸馏水使之溶解，然后转入容量瓶中。再加少量的蒸馏水洗涤烧杯数次，洗涤液均转入容量瓶中，最后定容至500ml。摇均后放于棕色瓶中备用。比色稀碘液：取碘原液2ml，加碘化钾20g，再用蒸馏水定容至500ml。摇均后放于棕色瓶中备用标准比色碘液：取碘原液15毫升，加碘化钾8克，用蒸馏水定容至500毫升。储藏于棕色瓶内。pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：称取磷酸二氢钠（Na2HPO4.12H2O）45.3g，柠檬酸（C6H8O7.H2O）7.74g，先在烧杯中使之溶解，然后转入容量瓶中定容至1

4、000ml。2%可溶淀粉溶液及标准糊精溶液配制2%可溶淀粉溶液：称取20g可溶淀粉，放入小烧杯中，加少量蒸馏水做成悬浮液。然后在搅拌下注入沸腾的700mL蒸馏水中，继续煮沸一分钟（透明），冷却后用pH6磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液定容至1000ml。标准糊精溶液：取0.06克化学纯糊精悬于少量水中调匀，然后倾入90毫升正在煮沸腾的蒸馏水中，冷却后定容至100毫升，滴加数滴甲苯（现配现用就不用加），冰箱保存。标准终点色溶液1、第一种标准终点色溶液取1mL标准糊精液和3mL标准稀碘液混合。2、第二种标准终点色溶液A液：精确称取氯化钴（CoCl.

5、6H2O）40.2493g和重铬酸钾（K2CrO7）0.4878g，用蒸馏水定容至500ml。B液：精确称取络黑T40mg，用蒸馏水定容至100ml。同时取A液40ml、B液5ml、混合后置于冰箱中待用。混合液在15天内使用有效。方法及步骤发酵培养基灭菌冷却后，利用接种环接种一环上周培养好的斜面菌种。37℃摇瓶培养（往复式110转/分钟）2天。2天后小漏斗脱脂棉花过滤发酵液。测定发酵液中α-淀粉酶酶活力单位（碘比色法）。根据结果选出1~2株进行下周的复筛试验。所选菌株产α-淀粉酶摇瓶发酵复筛试验的安排上课前一天下午17：00~17：30

6、将斜面菌种接种一环于5mL种子培养基中（装于18×180mL），37℃摇瓶培养（旋转式150转/分钟）14~16hr。上课当天上午8：00~8：30将上述摇瓶培养好的菌种，用1mL无菌吸管吸取1mL接种于50mL种子培养基中（装于250mL三角瓶），37℃摇瓶培养（旋转式150转/分钟）8~10hr。所选菌株产α-淀粉酶摇瓶发酵复筛试验的安排当天上课时间制备发酵培养基，3~5瓶/株菌（100mL/瓶），灭菌。将摇瓶培养好的菌种，用2mL无菌吸管吸取2mL接种于100mL发酵培养基中（装于500mL三角瓶），37℃摇瓶培养（旋往复式110

7、转/分钟）2天。2天后小漏斗脱脂棉花过滤发酵液。测定发酵液中α-淀粉酶酶活力单位（碘比色法）。根据结果可以判断所选菌株产酶能力是否稳定。实验α-淀粉酶活力测定方法介绍酶活力测定的方法碘比色法（有相应的国家标准）在一定反应条件下，1小时转化1g淀粉变为糊精的酶量定义为1个酶活力单位3，5-二硝基水杨酸比色法（DNS法）在一定反应条件下，1分钟反应生成1mg麦芽糖的酶量定义为1个酶活力单位注意：去除β-淀粉酶的干扰医学上的一些测定方法（专用试剂盒，通过生化仪器反应测定，需要微量快速）α-淀粉酶酶活力测定的原理底物（反应物）为淀粉产物为麦芽糖

8、、糊精等酶活力测定（碘比色法——目视）酶活力定义：在60℃下1小时内将1克淀粉转化为糊精的酶量称一个酶活力单位（5~10分钟反应完成）。淀粉及糊精检测原理：碘检测淀粉（紫蓝色，30分子以上）→红色糊精（红棕