土壤中产淀粉酶菌株的分离与鉴定及高活力淀粉酶的筛选

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1、土壤中产淀粉酶菌株的分离、纯化与鉴定及高活力淀粉酶菌株的筛选组数：第一组组员：王臣东李长花张晓晶杨明明1实验目的1.1掌握土壤中分离产淀粉酶菌株的方法。1.2进一步掌握和熟练无菌操作技术。1.3掌握分离纯化微生物的方法。1.4掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微生物的完整操作步骤。1.5巩固以前学的微生物学实验技术。1.6学习淀粉酶活性的测定方法。2实验原理α-淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。淀粉酶是能够催化淀粉水解，转化成葡萄糖的、麦芽糖及其他低聚糖的一类酶的

2、总称。从淀粉厂周围采集土壤样品，采用稀释法制备土壤稀释液，涂布于营养琼脂培养基平板上培养1天，在平板上滴加碘液，可产生淀粉酶的菌株水解淀粉遇碘不变蓝，在培养基表面形成透明圈。然后挑取可产生透明圈的菌株在平板划线培养2-3次，得到纯化的菌株，再测其酶活力大小。分离得到纯种这只是选种工作的第一步。所分得的纯种是否具有生产上所要求的性能，还必须要进行性能测定后才能决定取舍。性能测定的方法分初筛和复筛两种。初筛一般在培养皿上根据选择性培养基的原理进行。例如要测定淀粉酶的活力可以把斜面上各个菌株一一点种在含有淀粉的培养基表面，经过培养后测定透明

3、圈与菌落直径的比值大小来衡量淀粉酶活力的高低。复筛是在初筛的基础上做比较精细的测定。一般是将微生物培养在三角瓶中作摇瓶培养，然后对培养液进行分析测定。在摇瓶培养中，微生物得到充分的空气，在培养液中分布均匀，因此和发酵罐的条件比较接近，这样，测得的结果更具有实际的意义。3实验器材3.1样品：土样（甘肃昆仑生化公司周围采集的土样若干）3.2培养基3.2.1平板培养基：蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、可溶性淀粉2g、琼脂15-20g、自来水1000ml3.2.2斜面培养基：同3.2.13.2.3液体培养基：蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯

4、化钠5g、自来水1000ml3.3器材：30个90培养皿、酒精灯、接种环、14个试管、5个三角瓶（250ml）、涂布棒、移液管、恒温水浴锅、恒温培养箱、高压灭菌锅、超净工作台3.4试剂3.4.1淀粉酶活力测定：碘液3.4.2革兰氏染色：草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇3.4.32%淀粉溶液：2克淀粉加入少量热水使其溶解，再加入热水至100ml4实验步骤4.1培养基的制备及其仪器的灭菌4.1.1按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。加少量水熔解,再加入琼脂加热溶化最后补充水分，分装入试管内或三角烧瓶

5、内，加塞包扎。4.1.2试管中加入4.5ml水，三角瓶中加入玻璃珠和90ml水，将所有待灭菌仪器和培养基用报纸包扎，121℃，20分钟高压蒸汽灭菌。4.1.3搁置斜面及倒平板将灭菌的培养基冷至50℃左右，在超净工作台上，试管棉塞端搁在玻棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。三角瓶中的培养基倒平板，静置待用。4.2产淀粉酶菌株的分离、纯化4.2.1采集土壤样本由于甘肃张掖昆仑生化公司有生产淀粉的车间，所以在其周围有大量产淀粉酶的菌株，然后用小铲子去除5cm表土，取离地面5-15cm处的土样10-25g，盛于预先灭菌的牛皮纸袋中

6、扎紧，标明时间、地点和环境情况，放在冰箱中保存。4.2.2稀释称取土样10g，放入盛有90ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，至于摇床摇15min，使土样和水充分混合，使细胞分散。用一只无菌吸管吸取0.5ml土壤悬浮液加入盛有4.5ml含有无菌水的试管中充分混匀，此为10-1稀释液，依此稀释10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7几种稀释度的土壤溶液。4.2.3初步筛选4.2.3.1用稀释样品的不同吸管分别依次从10-7、10-6、10-5、10-4样品稀释液中，吸取0.2mL于冷却凝固的平板上，用涂布棒涂抹均匀。倒置

7、于37℃温箱中培养24小时。4.2.3.2培养24小时后，取出平板，注入1-2ml碘液，观察其透明圈，因淀粉遇碘变蓝色，如菌落周围有透明圈，说明该菌能产生淀粉酶使其水解。4.2.4分离纯化从平板上选取淀粉水解圈直径与菌落直径之比较大的单菌落，用接种环沾取少量菌株采用划平行线法或者三片区域划线法进行2-3次划线分离。A：平行画线法B：三片区域划线法4.2.5挑取单菌落划线至斜面上，培养24h后保存。4.2.6将上述单菌落进行革兰氏染色观察其形态　4.2.6.1涂片、干燥及固定4.2.6.2初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1分

8、钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。4.2.6.3媒染：先用新配的碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。4.2.6.4脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约15－20秒，后立即用流水冲洗。4.2.6.5复染：滴加