淀粉酶产生菌的筛选及酶活力测定

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1、南昌大学实验报告淀粉酶产生菌的筛选及酶活力测定一、实验目的：　　1、学习从土壤中分离微生物的方法；　　2、学习淀粉酶产生菌的筛选方法　　3、了解分光光度计法测定酶活力的原理及方法。二、实验原理：　　土壤中含有大量的微生物，将土壤稀释液涂在不同类型的培养基上，在适宜的环境中培养几天，细菌或者是其他的微生物便能在平板上生长繁殖，形成菌落。将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养集中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。故在淀粉培养基上长出的菌便是淀粉产生菌。在

2、培养基上滴碘液，淀粉被分解掉的部分不显现蓝色，出现透明圈，可以通过透明圈的大小来初步判断菌种产淀粉的能力。　　淀粉酶是指一类能催化分解淀粉分子中糖苷键的酶的总称，主要包括α－淀粉酶和β-淀粉酶等，α-淀粉酶可从淀粉分子内部切断淀粉的α-1,4糖苷键，形成麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖，是淀粉的粘度下降，因此又称为液化型淀粉酶。淀粉遇碘呈蓝色。这种淀粉-碘复合物在660nm处有较大的吸收峰，可用分光光度计测定。随着酶的不断分作用，淀粉长链被切断，生成小分子的糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，

3、因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定α-淀粉酶的活力。三、实验器材及试剂：　　1、培养基：（1）分离培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基（牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、溶于1000mL蒸馏水中，再加入15g琼脂粉，pH调至7.2，121℃灭菌15min，待冷却至50℃左右时，于超净工作台倒平板）（2）筛选培养基：淀粉培养基（可溶性淀粉20g,硝酸钾1g,磷酸氢二钾0.5g,氯化钠0.5g,硫酸镁0.5g,硫酸亚铁0.01g,琼脂20g,水1000毫升，调整pH值到7.2～7.4。）　　（3）

4、摇瓶培养：淀粉培养液。　　2、试剂：　　碘液、2%可溶性淀粉、pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、标准糊精溶液、0.5mol/L乙酸、0.85%生理盐水。　　3、器材：　　培养皿、锥形瓶、高压灭菌锅、超净工作台、恒温水浴锅、分光光度计。四、实验步骤：　　1、淀粉产生菌的筛选：　　（1）采集土样，并用无菌水稀释成菌悬液；　　（2）配置牛肉膏蛋白胨固体培养基及淀粉培养基，倒平板备用；　　（3）将制好的菌悬液与超净工作台上涂到牛肉膏蛋白胨平板上，于37摄氏度培养箱中培养一天；　　（4）挑取整个菌落，将其移入淀粉培

5、养基中，继续放在37摄氏度培养箱中培养两天；　　（5）将碘液滴在平板上，观察透明圈的大小。　　2、酶活力测定：　　（1）选产生透明圈最大的菌株进行摇瓶培养，将菌溶于5ml无菌生理盐水中，吸取此培养液加入淀粉培养液中，30摄氏度摇瓶培养72h。　　（2）酶液稀释：　　取发酵液进行4000r/min离心5min，取上清液，用缓冲液适当稀释。　　（3）标准曲线制作：　　准备七支试管，按照下表配置混合液。使用分光光度计策规定各管溶液在660nm下的OD值。然后以淀粉浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，做标准曲线。　　（4

6、）酶活力测定取稀释的粗酶液也按照下表中七号管的要求配置混合液，测得吸光度后，在标准曲线上查出相应的淀粉浓度，求出被酶消耗的淀粉量。管号1234567淀粉稀释液/ml2（0%）2（0.2%）2（0.5%）2（1.0%）2（1.5%）2（2.0%）2（2.0%）缓冲液/ml111111140摄氏度水浴保温5min管号1234567蒸馏水/ml1111110粗酶液/ml0000001　　40摄氏度水浴保温30min，然后放入沸水浴5min,每管加入稀碘液1ml　　（5）酶活力测定：　　酶活力以每毫升粗酶液在40摄

7、氏度，pH6.0的条件下每小时所分解的淀粉毫克数来衡量。五、实验结果：　　1淀粉产生菌的筛选：　　淀粉产生菌透明圈的检验图2、酶活力测定：(1)实验预测数据：管号1234567分解淀粉数/mg00.2350.5841.1071.3751.7881.540　（2）计算：样品的OD660=1.540　　查标准曲线可得：淀粉含量=1.540/0.047=32.766mg　　初始淀粉含量=2g/100ml×2ml=0.04g=40mg　　被消耗的淀粉含量=40mg－32.766mg=7.234mg　　酶活力=7.2

8、34mg/(1ml×0.5h)=14.468mg/(ml·h)六、实验结果分析：　　平板菌落水解圈直径大小受许多因素的影响,例如菌种特性、接种量大小、培养时间、酶的稳定性、温度范围、平板厚度等。绘制的淀粉含量标准曲线也会受实验室环境影响及误差而造成不准确，酶活力的表示方法也有多种，仅是一个相对的数值。