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1、利用SCGE方法检测南美白对虾冷冻精子DNA的损伤状况 精子的冷冻保存是遗传育种和种质资源保护的有效保障,但冷冻过程中的渗透压变化和冰晶形成以及抗冻剂的毒性均会对精子产生不同程度的损伤,其中包括精子DNA损伤。精子DNA作为遗传物种的载体,其完整性是子代正常发育的必要保障。 因此,冷冻保存过程中精子DNA的损伤程度应作为其保存效果的一个重要评价指标。单细胞凝胶电泳(singlecellgelelectrophoresis,SCGE)又称彗星试验(etassay),是一种检测DNA损伤的经典方法。细胞通过裂解、DNA解链等过程,经电泳使损伤的DNA从细胞核中溢出,朝阳极泳动,形成尾
2、状带,即彗尾,未损伤的DNA部分保持球形,两者共同形成彗星。彗尾的长度代表DNA迁移距离,荧光染色后彗尾的荧光强度与DNA损伤度相关,由此可以检测单个细胞的DNA损伤。该方法可以在荧光显微镜下直接观察细胞DNA的损伤情况,且具有快速、简便及灵敏的特点,已被广泛应用于家蚕精子细胞、河蟹精子细胞、鱼类精子细胞及人类精子细胞的DNA损伤检测中。 南美白对虾(Litopenaeusvannamei)是我国对虾养殖的重要品种之一,开展南美白对虾精子超低温冷冻保存研究,建立优质精子的超低温冷冻保存库,对其种质资源的保护和养殖品种的改良具有重要意义。有关南美白对虾精子超低温冻存的研究已有报道,但
3、迄今为止,南美白对虾冻存精子DNA损伤的研究尚未见报道。本研究以灭菌天然海水为基础液,以不同浓度的二甲基亚砜(dimethylsulfox-ide,DMSO)为抗冻剂,采用程序降温法对南美白对虾精子进行超低温冷冻保存,对于冻存的南美白对虾精子,以鲜精作为对照,利用SCGE方法对其DNA的损伤状况进行研究,以期为南美白对虾精子超低温冷冻保存技术的改进及冻精质量的检测提供参考。 1、材料与方法 1.1材料 1.1.1试验材料试验所需南美白对虾来自广西国家级南美白对虾育种中心培育的优良种虾,成熟雄虾体长12.49cm±0.42cm,体重39.57g±3.4
4、6g,培育亲虾池水温27℃~28℃,盐度28‰~30‰。带有成熟精荚的雄虾精囊发白、饱满,完整并成熟的精荚通过用拇指轻轻挤压获得,精荚平均重量46.41mg±7.43mg,挤压出的精荚放入灭菌的4℃天然海水中短暂保存。 1.1.2主要试剂Trypsin1∶250(胰蛋白酶)、DMSO、Na2EDTA(乙二胺四乙酸二钠)、TritonX-100,Amresco公司产品;NMA(正常熔点琼脂糖),Biolauroylsarcosine(十二烷基肌氨酸钠),Sigma公司产品;蛋白酶K,Merck公司产品;GelRed,Biotium公司产品;其
5、他试剂均为国产分析纯。 1.1.3试剂配制Trypsin1∶250使用灭菌天然海水配置成1g/L的溶液;NMA和LMA用不含钙、镁离子的磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)配制,浓度均为10g/L;细胞裂解液包含2.5mol/LNaCl,100mmol/LNa2EDTA,10mmol/LTris,10g/L肌氨酸钠,pH10,临用前加10mL/LTritonX-100,100mL/LDMSO;细胞消化液包含2.5mol/LNaCl,5mmol/LTris,0.5g/L肌氨酸钠,pH7.4,临用前加入蛋白酶K,终浓度0.5mg/mL;电泳液包含300mmol/L乙酸钠,100mmol/
6、LTris,pH=10;中和液为0.4mol/LTris,加HCl调至pH7.0;GelRed染色液是用双蒸水将GelRed10000储液稀释约3300倍到0.1mol/LNaCl中配成稀释液。 1.1.4主要仪器。IBF-100程序降温仪,英国Planer公司产品;Nikon80i荧光显微镜,日本NI-KON公司产品;DYY-8B型电泳仪,北京市六一仪器厂产品;JY-SPCT型电泳槽,北京君意东方电泳设备有限公司产品。 1.2方法 1.2.1试验材料准备 收集的南美白对虾精荚在37℃水浴条件下用1g/L的胰蛋白酶消化5min,150mL/L的胎牛血清终止消化反应,500r/
7、min离心10min收集游离精子上清液,收集的上清再经2000r/min离心5min,获得游离精子沉淀,加入0.5mL灭菌天然海水轻轻混匀成精液后置于4℃冰箱备用。 1.2.2精液冷冻与复苏 南美白对虾精子的超低温保存是以灭菌天然海水(盐度28‰~30‰)为基础液,在收集的精液中加入终浓度为50、100、150、250mL/L的DMSO作为抗冻剂,使用程序降温仪进行进一步的降温,降温程序为:4℃平衡30min,以-5℃/mi
