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《scge法检测dna损伤(包括dna单链断裂和dna交联)》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。
1、SCGE法检测DNA损伤SCGE的原理（中性电泳液，高盐和变性剂检测双链断裂；碱性检测单链，双链断裂和碱不稳定性）SCGE技术是一种在单细胞水平上检测有核细胞DNA损伤和修复的方法。该技术的原理是基于有核细胞的DNA分子量很大，DNA超螺旋结构附着在核基质中，用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载玻片上，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜及其它生物膜破坏，使细胞内的RNA、蛋白质及其它成分进入凝胶，继而扩散到裂解液中，唯独核DNA仍保持缠绕的环区(Loop)附着在剩余的核骨架上，并留在原位。如果细胞未受损伤，电泳中核DNA因其分
2、子量大停留在核基质中，经荧光染色后呈现圆形的荧光团，无拖尾现象。若细胞受损，在中性电泳液(pH8)中，核DNA仍保持双螺旋结构，偶有单链断裂(SSBs)并不影响DNA双螺旋大分子的连续性。只有当DNA双链断裂(DSBs)时，其断片进入凝胶中，电泳时断片向阳极迁移，形成荧光拖尾现象，形似彗星。如果在碱性电泳液(pH>13)中，先是DNA双链解螺旋且碱变性为单链，单链断裂的碎片分子量小即可进入凝胶中，在电泳时断链或碎片离开核DNA向阳极迁移，形成拖尾。细胞核DNA受损愈重，产生的断链或碱易变性断片就愈多，其断链或断片也
3、就愈小，在电场作用下迁移的DNA量多，迁移的距离长，表现为尾长增加和尾部荧光强度增强。因此，通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可定量测定单个细胞DNA损伤程度。1.仪器及试剂冰箱，载玻片，水平电泳槽，荧光显微镜。不含Ca2+、Mg2+的PBS(PH=7.4)；正常溶点琼脂糖（NMA）及低溶点琼脂糖（LMA）（0.6％溶于PBS）；细胞裂解液（2.5MNaCl,100mMNa2EDTA,10mMTris-HCl,1%肌氨酸钠,PH=10,用前加1％TritonX-100,10%二甲亚砜（DMSO））；电泳缓冲
4、液（0.3MNaOH,1mMNa2EDTA,PH=13）；0.4MTris-HCl（PH=7.5）；无水乙醇；20-30μg/mL溴化乙锭（EB）。2.方法1.在体外实验中,将对数期生长的细胞用0.25%胰蛋白酶消化,收集细胞备用。在体内实验中,取需测试的脏器或组织,用磷酸缓冲液(PBS,PH7.4)洗净后,剪至糜状滴加PBS(PH7.4)研磨,过300目筛子,收集细胞,悬浮于PBS(PH7.4)中,细胞密度为（1-5）x104-6个/mL（血细胞计数板最中央每小格0.5个细胞）,台盼蓝染色、镜检、细胞存活率90%
5、以上,即可进行以下操作。2.样品处理：1）通过尾动脉取血，肝素或枸椽酸钠抗凝，800r/min离心5min，加等体积无钙镁磷酸缓冲液，获得细胞悬液。a.枸椽酸钠抗凝:有2Na3C6H5O7。和2Na3C6H5·11H2O等多种晶体。通常用前者配成109mmol/l(32g/l)水溶液（也有用106mmol/l浓度），与血液按1：9或1：4比例使用。枸椽钠对凝血V因子有较好的保护作用。b.肝素（heparin）每毫升血液抗凝需要持素15±2.5Iu.c.EDTA盐经1000C烘干，抗凝作用不变，通常配成15g/L水溶
6、液，每瓶0.4ml，干燥后可抗凝5ml血液。EDTA盐对红、白细胞形态影响很小.2）过氧化氢处理：细胞悬液分成两份:A份1ml；B份0.9ml。B份里再加0.1ml5mmol的过氧化氢，混匀。全部冰浴1小时。完后检测细胞存活率(台盼蓝染色、镜检)(过氧化氢处理用于检测DNA交联)。3）应用细胞悬液制备：4度下，1000r/min离心5分钟。去上清，加PBS(PH7.4)。每份制作2片凝胶。3.制胶将载玻片用砂纸(粒度No.380)磨出痕迹,以便凝胶附着.将37C正常溶点0.6％琼脂糖液（溶于不含Ca2+、Mg2+的
7、PBS，需要沸水加热）75-100μl铺展到预热的磨痕载玻片上，作为第一层凝胶，盖上盖玻片4℃凝固10分钟以上,去掉盖玻片后加入制备的细胞悬液85μl(10μl含1000个细胞的PBS和75μl0.6%的低熔点琼脂糖(LMA)在37℃混匀)铺展到载玻片上作为第二层,4℃至少10分钟,凝固后再铺展低溶点0.6％琼脂糖100μl作为第三层,使载玻片上琼脂糖呈“三夹层”式.（注意：NMA适宜浓度0.5%～1%,过高或过低将造成凝固速度过快而不易铺平或粘着力低而脱落,铺胶前载玻片预热,有利于铺植平整。LMA凝胶浓度直接关系
8、到DNA迁移长度,0.6%较适宜。第3层LMA可不铺。微量加样器吸头前端残留凝胶勿吹出,以防形成气泡。移去盖玻片时注意勿损伤胶膜）4.裂解4℃凝固后去掉盖玻片，将载玻片浸人新配制的4℃预冷细胞裂解液（含2.5MNaCl,100mMNa2EDTA,10mMTris-HCl(PH=10)，用前加1％TritonX-100,10%二甲亚砜（DMSO）），裂解不少于
