单细胞凝胶电泳检测南美白对虾冷冻精子的 DNA 损伤.pdf

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1、动物医学进展。2014，35(9)：58—62ProgressinVeterinaryMedicine单细胞凝胶电泳检测南美白对虾冷冻精子的DNA损伤杨春玲，赵永贞，彭敏，陈晓汉，李咏梅，陈秀荔(广西水产科学研究院广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室，广西南宁530021)摘要：应用单细胞凝胶电泳(SCGE)技术检测南美白对虾冷冻精子的DNA损伤状况，以评价南美白对虾精子超低温冷冻保存的效果。对南美白对虾精子细胞进行预处理，在碱性电泳液中使核DNA双链解链变性后电泳，Ge1Red染色液染色10min后，在荧光显微镜下随机观察50个左右的核DNA，CASP分析软件分析测量DNA

2、迁移的各种参数，并按彗尾长度及荧光强度对DNA损伤划分等级。鲜精和各冻精组的SCGE检测结果显示，随抗冻剂二甲基亚砜(DMSO)浓度的升高，彗星尾部DNA含量、尾长、尾距、Olive尾距增大，彗星率及损伤系数也逐渐增大；鲜精基本无损伤，50mL／LDMSO为抗冻剂组基本为轻度损伤，100mL／L和150mL／LDMSO为抗冻剂组以轻度损伤和中度损伤为主，250mL／LDMS0组中度损伤和重度损伤的比例进一步增大，但完全损伤没有出现。分析认为，抗冻剂DMSO的浓度是影响冻后精子DNA损伤的主要因素。关键词：南美白对虾；精子；超低温冷冻保存；单细胞凝胶电泳；DNA损伤中图分类号：

3、$917．4文献标识码：A文章编号：1007—5038(2014)09—0058—05精子的冷冻保存是遗传育种和种质资源保护的温冷冻保存研究，建立优质精子的超低温冷冻保存有效保障，但冷冻过程中的渗透压变化和冰晶形成库，对其种质资源的保护和养殖品种的改良具有重以及抗冻剂的毒性均会对精子产生不同程度的损要意义。有关南美白对虾精子超低温冻存的研究已伤，其中包括精子DNA损伤。精子DNA作为遗传有报道口，但迄今为止，南美白对虾冻存精子DNA物种的载体，其完整性是子代正常发育的必要保障。损伤的研究尚未见报道。本研究以灭菌天然海水为因此，冷冻保存过程中精子DNA的损伤程度应作基础液，以不

4、同浓度的二甲基亚砜(dimethylsulfox—为其保存效果的一个重要评价指标。单细胞凝胶电ide，DMSO)为抗冻剂，采用程序降温法对南美白对泳(singlecellgelelectrophoresis，SCGE)又称彗星虾精子进行超低温冷冻保存，对于冻存的南美白对试验(cometassay)，是一种检测DNA损伤的经典虾精子，以鲜精作为对照，利用SCGE方法对其方法_】j。细胞通过裂解、DNA解链等过程，经电泳DNA的损伤状况进行研究，以期为南美白对虾精子使损伤的DNA从细胞核中溢出，朝阳极泳动，形成超低温冷冻保存技术的改进及冻精质量的检测提供尾状带，即彗尾，未损伤的D

5、NA部分保持球形，两参考。者共同形成“彗星”。彗尾的长度代表DNA迁移距1材料与方法离，荧光染色后彗尾的荧光强度与DNA损伤度相1．1材料关，由此可以检测单个细胞的DNA损伤。该方法1．1．1试验材料试验所需南美白对虾来自广西可以在荧光显微镜下直接观察细胞DNA的损伤情国家级南美白对虾育种中心培育的优良种虾，成熟况，且具有快速、简便及灵敏的特点，已被广泛应用雄虾体长12．49cm+0．42cm，体重39．57g-L_-3．46g，于家蚕精子细胞L3]、河蟹精子细胞]、鱼类精子细培育亲虾池水温27。C～28℃，盐度28‰～30‰。胞_5及人类精子细胞[1”]的DNA损伤检测中。

6、带有成熟精荚的雄虾精囊发白、饱满，完整并成熟的南美白对虾(Litopenaeusvannamei)是我国对精荚通过用拇指轻轻挤压获得，精荚平均重量46．41虾养殖的重要品种之一，开展南美白对虾精子超低mg±7．43mg，挤压出的精荚放入灭菌的4℃天然收稿日期：2014—02—12基金项目：广西科技攻关项目(桂科攻1222013一1)；广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室开放课题项目(GXKL—AQUA一2O12-C-03)作者简介：作查者玲(1979一)，-k-，山东曹县人，副研究员，硕士研究生，主要从事水产遗传育种与健康养殖研究。*通一讯杨春玲等：单细胞凝胶电泳检测南美白对

7、虾冷冻精子的DNA损伤59海水中短暂保存。溶解为止。1．1．2主要试剂Trypsin1：250(胰蛋白酶)、1．2．3鲜精与冻精DNA的SCGE检测按徐西DMSO、Na2EDTA(乙二胺四乙酸二钠)、TritonX一长等[7方法略加改进，具体步骤如下：①稀释：精液100，Amresco公司产品；NMA(正常熔点琼脂糖)，用4℃的PBS(pH7．4)离心洗涤2次(4℃，Biowest公司产品；LMA(低熔点琼脂糖)、Tris(三2000r／rain)，每次10rain，鲜精及冻精均用PBS稀羟甲基氨基甲烷