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1、·400·山西医药杂志2002年10月第31卷第5期 ShanxiMedJ,October2002,Vol31,No.5·综 述·单细胞凝胶电泳检测单细胞DNA损伤山西医科大学(030001)杨建一 彭 芸 李 莉 遗传毒理学家主要关注的三大遗传学损伤,即基因突311 细胞来源及处理:从理论上讲,SCGE可用来检测任[8]变、染色体畸变及染色体数目改变。这些损伤多因DNA受何真核细胞的DNA损伤。Kleinsasser等用SCGE分析[1]损所致,其本质是相同的,区别在于其损伤的程度。由此了人外周血淋巴细
2、胞与上消化道黏膜细胞对遗传毒性物质[9]DNA损伤与修复就成为生物医学领域特别是遗传毒理学的敏感性比较,Eastham等用成纤维细胞进行了该项实及肿瘤学等领域的核心内容之一。传统的毒理学检测终点验,药物对睾丸细胞和精子的DNA损伤作用也曾用SCGE[10]是组织病理学改变,过程繁琐且不理想。迄今为止检测进行综合分析。此外表皮细胞、肿瘤细胞及实验动物的[2]DNA损伤与修复最敏感的终点是测量DNA单链断裂。实质脏器细胞都可作为靶细胞。细胞来自培养的细胞或从[11]本文所论述的单细胞凝胶电泳(singlecell
3、gel活体组织分离的细胞。Singh等提出在玻片上或直接制electrophoresisassay,SCGE),又称彗星实验(cometassay)成细胞悬液,加入受试物孵育一段时间后去除受试物,检测[12]或微凝胶电泳(microgelelectrophoresis,MGE),正是一种DNA损伤;另外,观察处理后培养不同时间的“彗星”以在单细胞水平上检测有核细胞DNA断裂的一项新技术。[13]研究DNA的修复情况。体内实验时可以给动物以不同[3]自Ostling等成功应用以来经不断改进,已成为一种快途径染毒
4、,间隔一段时间或取不同时间段分离组织细胞进速、灵敏、简便的检测DNA损伤的方法。行SCGE分析。1SCGE的发展312 制胶:以无钙、镁磷酸缓冲盐溶液(PBS)配制015%正Ostling和Johanson首先发明了微凝胶电泳技术,将常熔点凝胶和低熔点凝胶,加热熔化后,备用制胶。第一层细胞包埋于显微玻片上的低熔点琼脂糖凝胶中,用高浓度胶的制备:在毛玻片上滴加110LL015%正常溶点凝胶,加去污剂和盐裂解,然后在中性条件下短时间电泳。DNA断盖盖玻片。此层的目的是促进含细胞的胶层与玻片附着。4片就会从细胞核向
5、阳极迁移,从而形成“彗星”样拖尾,尾指℃固化10min。第二层胶的制备:以PBS将受试细胞配成8104向阳极。这种方法检测的是双链DNA断裂(double21×10～1×10个öL细胞悬液,取50LL(约1×10个细strandedbreaks,DSBs),不能测定单链断裂(single2胞)按1∶3的比例与015%低熔点凝胶混合。待第一层胶strandedbreaks,SSBs),而许多物质诱导的DNA单链断裂凝固(平整,有光泽)后揭去盖片,滴加75LL015%低熔点较双链断裂高5～2000倍,所以这种方法
6、有一定的局限凝胶与细胞悬液混合液,加盖盖玻片,4℃固化10min;第性。三层胶的制备:揭去盖玻片再滴加110LL不含细胞的[4]1988年Singh等提出碱性单细胞凝胶电泳方法。在015%低熔点凝胶,同样加盖,4℃固化10min。碱性条件下可使DNA变性并作用于碱性脆性位点,同时313 裂解:去掉盖玻片,将凝胶片浸入冰冷的裂解液中(含使RNA降解防止干扰,经溴化乙锭(EB)染色后显示明显215molöLNaCl,100mmolöLNa2EDTA,10mmolöL的断裂,灵敏度大大提高。Tris,1%肌氨酸钠,
7、10%DMSO,1%TritonX2100),4℃裂2SCGE的原理解1h,使细胞裂解,DNA松散。SCGE的原理还不是很清楚,但目前一般观点认为在314 电泳:裂解后取出玻片,用PBS缓冲液漂洗3次后置细胞核中DNA是呈环状附着在核基质上的,细胞分裂时于水平电泳槽内,加入pH=13的电泳缓冲液(含1mmolöL核基质被溶解、抽提,但DNA仍保留核样结构。当断裂剂Na2EDTA,300mmolöLNaOH)至没过玻片2～3mm,使作用于细胞时,DNA出现单链或双链断裂即在DNA链上DNA解螺旋20min。之后
8、,接通电源,在电压23～25V,电[5]出现缺口,使DNA超螺旋变得松弛。高pH(>13)使流280～300mA的条件下电泳30min。电泳完毕后用PBSDNA变性,解螺旋,同时由于缺口暴露了阴电荷,在电场力漂洗3次,每次3min。[6]作用下DNA断片向阳极迁移。但DNA一端仍附着于核315 染色:溴乙锭(EB)染色,胶上滴加30LL(20mgöL)DNA,其迁移距离受到限制。DNA的移行可用EB
