单细胞凝胶电泳技术检测小鼠成纤维细胞DNA的氧化损伤及修复.doc

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1、单细胞凝胶电泳技术检测小鼠成纤维细胞DNA的氧化损伤及修复【关键词】单细胞凝胶电泳；DNA单链断裂；DNA氧化损伤；DNA修复　　摘要：目的观察小鼠成纤维细胞由过氧化氢(H2O2)引起的DNA损伤及其修复，并详细介绍单细胞凝胶电泳技术。方法培养NIH3T3细胞，H2O2造成细胞氧化损伤，单细胞凝胶电泳技术(SCGE，CometAssay)检测细胞DNA的损伤情况。结果①建立了H2O2致NIH3T3细胞DNA损伤的分级图谱；②H2O2引起的小鼠成纤维细胞DNA单链断裂与H2O2的浓度呈依赖性关系；③细胞在除去H2O2后15min

2、已出现明显修复，多数修复可在1h内完成，但少数修复可能需要较长时间才能完成。结论单细胞凝胶电泳技术是一种简便、敏感的检测DNA氧化损伤的方法。　　关键词：单细胞凝胶电泳；DNA单链断裂；DNA氧化损伤；DNA修复　　OxidantinducedDNAdamageandthereparation　inNIH3T3mousefibroblastsbysinglecellgelelectrophoresis　　ABSTRACT:ObjectiveTostudyH2O2inducedsinglestrandbreaks(SSB)for

3、mationinDNAandthereparationinNIH3T3mousefibroblastsbysinglecellgelelectrophoresistechnique(SCGE,CometAssay)andtointroduceSCGE.MethodsTheNIH3T3mousefibroblastswereincubated,andcelldamagewasinducedbyH2O2anddeterminedbySCGE.Results①H2O2induceddamageclassgraphoftheDNACo

4、metintheNIH3T3mousefibroblastswasestablished.②H2O2inducedSSBwasH2O2dosedependent.③ThereparationofthedamagedDNAwastimedependentandcouldbeachieved15minafterincubation.Thedataindicatedthatmostreparationswerecompletedwithin1hour,butafewmighttakelongertime.ConclusionSing

5、lecellgelelectrophoresistechniqueisasimpleandsensitivemethodtodetermineoxidationinducedsinglestrandbreaks(SSB)formationinDNA.　　KEYWORDS:singlecellgelelectrophoresistechnique(SCGE);singlestrandbreaks(SSB);oxidantinducedDNAdamage;DNAreparation　　许多资料显示染色体的诱变、肿瘤的形成以及衰老都

6、与DNA损伤相关联[1]。观察药物对DNA氧化损伤及修复的影响，对全面阐述药物抗氧化作用以及探讨药物的作用机理具有重要意义。目前检测DNA损伤的方法主要有：①用高效液相色谱法检测细胞、组织或尿液等体液中DNA碱基修饰的代谢产物8羟基鸟嘌呤[2]；②用单细胞凝胶电泳技术(SCGE,CometAssay)检测细胞的DNA损伤[34]。作者在日本研修期间用单细胞凝胶电泳技术在小鼠成纤维细胞上观察了由H2O2引起的DNA的损伤及其氧化损伤后DNA的修复，现将这种方法及实验结果介绍如下。4　　1材料与方法　　1.1药品试剂细胞培养介质D

7、MEM和小牛血清(FBS)购自Sigma公司；细胞培养平皿为Coring公司产品；CometAssay试剂盒购自Trevigen公司。　　1.2细胞培养及H2O2损伤方法DMEM培养液中加入10%(体积分数)小牛血清(FBS)、青霉素和链霉素各100u/mL。NIH小鼠成纤维细胞(NIH3T3)用该培养液调整至3.3×104个细胞/mL的细胞悬液，将细胞接种于直径35mm的培养皿(3mL/皿)，于37℃、5%(体积分数)CO2的细胞培养箱中培养24h。置换成不含小牛血清的DMEM，在培养皿中加入H2O2使终浓度分别为0.3-0

8、.5mmol/L，培养15min。再次置换成新鲜的含10%(体积分数)小牛血清的DMEM，分别于H2O2处理后即刻、15、30、60、120min收集细胞进行单细胞凝胶电泳分析。　　1.3单细胞凝胶电泳(CometAssay)本方法的原理是先将细胞固定在葡聚糖凝胶中，用碱(0