甘露聚糖酶水解酵母细胞壁水解条件的研究

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1、β-甘露聚糖酶水解酵母细胞壁水解条件的研究摘要：采用单因素实验研究了底物浓度、加酶量、反应时间、反应温度和pH值5个因素对β-甘露聚糖酶水解酵母细胞壁的影响。在单因素实验基础上，通过正交实验确定了β-甘露聚糖酶水解酵母细胞壁的最佳水解条件为：底物浓度为8%，加酶量为55%，水解时间为4.5h，水解温度为55℃，pH值6.0。关键词：β-甘露聚糖酶；水解条件；正交实验；优化Studyonoptimizationofhydrolysisbyβ-mannanaseinyeastcellwallAbstract:Theeffectsoffivefactorsontheβ-mannanenz

2、ymehydrolysisofyeastcellwall,suchasthesubstrateconcentration,enzymedosage,reactiontime,reactiontemperatureandpHvalue,werestudied.Theorthogonaltestshowedthatthebestoptimizedhydrolysisconditionswereasfollow：pHvalueof6.0,temperatureof55℃,timeof4.5hours,enzymedosageof55%,substrateconcentrationof8%

3、.Keywords:β-mannanase;decomposebyprotease;orthogonalexperiment;optimizeβ-甘露聚糖酶(β-mannanase)是一类能够水解含有甘露糖苷键的甘露聚糖(包括异甘露聚糖)的内切水解酶[1]，广泛存在于动植物和微生物中，其主要水解产物为单糖、二糖、三糖、四糖等低聚糖[2]。随着人们对甘露寡糖生理功能的发现和对自然界中纤维素资源的利用，β-甘露聚糖酶的研究和开发进入了一个新高潮，已被广泛应用于食品、药品、饲料、造纸、印刷业、印染、纺织、石油开采和生物学研究等领域[3-6]。目前，β-甘露聚糖酶主要用于水解含有β-1,4

4、-D-甘露糖苷键的魔芋粉、角豆角、瓜儿豆等植物原料以生产甘露寡糖[7-8]，而利用β-甘露聚糖酶水解酵母细胞壁中α-1,6-甘露聚糖制取甘露低聚糖的研究未见详细报道[9]。2002年以来我国啤酒产量实现连续五年稳居世界第一，有丰富的酵母甘露聚糖资源。本实验是利用实验室保藏的高产β-甘露聚糖酶菌株产生的β-甘露聚糖酶水解酵母细胞壁中α-1,6-甘露聚糖来制取甘露低聚糖，通过研究底物浓度、加酶量、反应时间、反应温度和pH值对β-甘露聚糖酶水解酵母细胞壁效果的影响，以确定β-甘生物工程·7·FOODSCIENCEANDTECHNOLOGY食品科技2009年第34卷第2期露聚糖酶水解酵母细

5、胞壁获得甘露低聚糖的最优条件，为今后有效利用啤酒发酵残渣生产甘露低聚糖提供参考。1材料与方法1.1实验材料酵母细胞壁：自制；高产β-甘露聚糖酶菌株F1-5-10：实验室保藏。发酵培养基：酵母细胞壁20g，KNO31g，K2HPO4·3H2O0.5g，MgSO4·7H2O0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH7.4～7.6。1.2粗酶液的制备取高产β-甘露聚糖酶菌株(F1-5-10)在发酵培养基中活化，按10%的接种量接种到1000mL的三角瓶中，摇床培养(200r/min)48h，500r/min离心5min，去除杂质，上清液于9000r/m

6、in、4℃离心10min，取上清液[10]。1.3酶活力的测定标准曲线的绘制：取标准甘露糖水溶液0、0.05、0.1、0.2、0.3、1.4mg/mL各1mL分别置于6支具塞试管中，各加入DNS试剂1mL，沸水浴5min，显色，然后以流水迅速冷却，加蒸馏水8mL，以空白液调零，在540nm处测定吸光度，绘制标准曲线。0.9mL0.5%(w/v)角豆胶溶液(由pH值7.0的KH2PO4-NaOH缓冲液配制)，50℃保温5min，加入0.1mL适当稀释的酶液，60℃水浴10min，DNS法[2]测还原糖含量。在上述条件下，每min释放相当于1μmolD-甘露糖的还原糖所需的酶量为一个酶

7、活单位(U)。2结果与分析2.1标准曲线的绘制按照1.3方法测得数据绘制标准曲线见图1。2.2粗酶液的酶活由酶活力的定义计算得到粗酶液的酶活为78.59U/mL。2.3单因素条件下β-甘露聚糖酶水解效果的研究2.3.1加酶量对β-甘露聚糖酶水解效果的影响取自制酵母细胞壁0.8g，加入到水、酶液中，加入的酶液占总体积的30%、40%、50%、60%和70%。水解5h后，迅速取出放在沸水浴中灭酶活。离心取上清液，测定水解液中甘露低聚糖的含量。加酶量对β-甘露聚糖酶水解效果