单克隆抗体的制备及应用2010ppt课件

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1、单克隆抗体的制备许宁南京医科大学卫生部抗体技术重点试验室一、概论抗体的研究已有百余年的历史白喉杆菌抗毒素抗体的定义免疫球蛋白：结构概念抗体：功能概念与相应抗原特异结合具有免疫功能的球蛋白抗原抗原：能与抗体结合的物质免疫原：可刺激产生抗体半抗原只能结合，不能诱发与载体结合抗原决定簇：表位抗体生产技术作为抗体研究的基础得到迅速发展抗体生产技术的三个时代多克隆抗体单克隆抗体基因工程抗体基因工程抗体人源化全人源小型化噬菌体抗体库随着分子生物学发展，单抗技术有了新的突破嵌合抗体改型抗体人源化抗体转人基因小鼠杂交瘤系统小鼠杂交瘤系统大鼠杂交瘤系统兔杂交瘤系统人杂交瘤系统人脾细胞/淋

2、巴细胞×鼠骨髓瘤细胞人脾细胞/淋巴细胞×人骨髓瘤细胞三、单克隆抗体的制备生物方法：病毒诱导化学方法：PEG融合物理方法：电融合融合前的准备抗体检测方法的建立针对抗体的特异性：ELISA针对抗体使用目的WB细胞染色免疫组化小鼠的标记染色法（常用）3.5%－5%的苦味酸溶液先左后右，从前到后双色：双位数打孔法戴环法免疫小鼠一般选择健康8-12周龄的雌性BALB/C小鼠：融合用骨髓瘤细胞多来自此品系小鼠常用的免疫途径：腹腔注射：完全福氏佐剂---初次不完全福氏佐剂---加强静脉注射脾内包埋、注射：抗原少、快速、高效3.一般要经过初次免疫、加强免疫、冲击免疫三个过程4.免疫前取

3、血作阴性对照，加强免疫时取血检测特异性抗体的产生和效价，决定冲击免疫和融合时机免疫流程每只小鼠100μg抗原与完全福氏佐剂等量混匀，腹腔注射2~4周后，同量抗原加不完全福氏佐剂追加免疫一次（检测抗体效价，必要时重复步骤2）同量抗原不加佐剂静脉冲击免疫一次冲击免疫后3~4天获取小鼠脾细胞亲本细胞的选择骨髓瘤细胞：本身不分泌抗体次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型（HGPRT-）或者胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）的骨髓瘤细胞B淋巴细胞：经特定抗原免疫能产生目的抗体免疫动物种系要与骨髓瘤细胞系一致或有相近亲源关系细胞准备复苏小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞，培养至细胞对数生长期融合收

4、集小鼠脾细胞取血：阳性血清、减少脾内红细胞处死小鼠消毒小鼠：75%酒精浸泡取出脾脏：分层打开、更换器械分离脾细胞：研磨法、注射法离心收集（1500rpm,5min）收集骨髓瘤细胞（1500rpm,5min）无血清培养基分别冲洗脾细胞和骨髓瘤细胞各三遍细胞计数：脾细胞/骨髓瘤细胞=2-10/1融合：均在37℃水浴中进行，加入融合剂时需连续搅拌1min：0.7mlPEG加入混合细胞中2min：继续搅拌3min：1ml无血清培养液4min：3ml无血清培养液5-8min：加至30ml离心：800-1000rpm,5min加入HAT选择培养基铺板注意事项1.PEG：MW1000

5、~4000浓度30%~50%作用时间2.培养液缓缓加入：渗透压改变3.加入和倾倒PEG时均需彻底融合细胞的选择原理HAT选择培养基荧光流式细胞仪（FACS）分选A.HAT选择培养基1964年Littlefield首先发明了HAT（H—Hypoxanthine次黄嘌呤，A—Aminopterin甲氨喋呤，T——Thymidine胸腺嘧啶核苷）培养基的选择培养HAT选择性培养基是根据次黄嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸生物合成途径设计的细胞内DNA的生物合成途径主要生物合成途径补救途径甲氨喋呤次黄嘌呤次黄嘌呤核苷酸HGPRT+TK+胸腺嘧啶胸腺嘧啶脱氧核苷酸DNA小鼠HGPRT-骨髓

6、瘤细胞（Sp2/0）融合后的细胞在HAT选择培养基中结局Sp2/0+BSp2/0Sp2/0BBSp2/0B死亡死亡存活B.荧光流式细胞仪分选（FACS法）两种颜色荧光素分别标记两种融合细胞异硫氰酸荧光素（FITC）罗丹明筛选同时有两种荧光素的融合细胞所筛细胞直接接种96孔板融合后的管理换液Day3：半量换液Day7：半量换液观察融合细胞生长状况，有无细胞克隆的出现检测一个高倍视野大小检测上清间接法筛选阳性孔入24孔板扩增固定相抗原2E亚克隆软琼脂克隆法有限稀释法(常用)：从阳性分泌孔收集杂交瘤细胞，经逐步稀释，使每孔只有一个细胞mm1144332242444233324

7、4444222443333333333亚克隆细胞的培养添加饲养细胞：胸腺细胞提高血清浓度：20%添加细胞因子：IL-6，胰岛素多次亚克隆（2-3次）确保每个孔中只有来自于一个细胞的克隆群淘汰核型不稳定的克隆，获得稳定基因型和稳定分泌抗体的克隆扩增培养、冻存细胞四、单克隆抗体的大量获得与纯化小鼠腹水诱导细胞培养上清饱和硫酸铵沉淀(40%)离子交换法(DEAE)胶体过滤法(Sepharose)亲和层析法(ProteinA、G)纯化方法体外培养培养上清中的牛血清影响纯化效果逐步降低培养基中血清浓度20%-10%-5%-2.5%-1%-0把握时机