临床基因扩增检验培训班-pcr污染与预防

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1、聚合酶链式反应及其污染与预防污染的措施协和医院李一荣临床基因扩增检查验收中存在的问题5份标本(2份标本小于最低检测限)检测结果:(1)与预期靶值完全符合(2)阴性对照出现阳性，小于最低检测限的标本为阳性(3)阳性标本高于预期值2个数量级.(4)所有阳性标本均低于预期靶值1个及以上数量级.聚合酶链式反应成功的关键因素保证标本质量与模板质量PCR反应体系与反应条件的优化PCR相关仪器的校准灵敏度、特异性批内与批间检测的可重复性预防污染的发生(假阳性)StephenABetal.Real-timereversetranscriptionPCR(qRT-PCR)anditspotenti

2、aluseinclinicaldiagnosis.ClinicalScience(2005)109,365–379标本质量与模板质量RealtimePCR，2006认真分析标准曲线观察PCR反应体系与反应条件是否正确1.相关系数（r2）：越接近1越好2.斜率（slope）：-3.1~3.6（100%的扩增效率）3.截距（intercept）：33.3~36.5（100%的扩增效率）Ct=A+Blg[C]Ct3733123斜率=-3.5斜率=-2.0标准曲线的要求扩增效率：通常要求达到90%~100%，如小于90%，必须重新优化。对应的斜率{［10（-1/斜率）］-1}为-3.1~-3.

3、6。截距（灵敏度）：33.3~36.5（100%效率）相关系数：检测标准品稀释的准确性与加样的准确性（≥0.99）RealtimePCR，2006斜率增加：（1）标准品为非线性的质粒。（2）反应体系与反应条件未优化好。（3）存在Taq酶的抑制剂或Taq酶的活性下降。（4）加样不准确斜率降低：污染或加样不准确。截距增加：（1）标准品的浓度不正确。（2）标准品降解（反复冻融或未加载体DNA的低浓度标准品）截距降低：（1）标准品的浓度不正确。（2）污染。PCR相关仪器的校准批内与批间检测的可重复性TBDNA（+）污染Why？方法本身？实验人员？实验场地？实验试剂？聚合酶链式反应与诺贝尔化学奖

4、美国科学家KaryB.MullisKaryB.Mullis与聚合酶链式反应“我感激诺贝尔评奖委员会，在我还能够尽情享受生活的年龄及时地把诺贝尔奖授予给我”PCR的污染源交叉污染。来自试验材料。“遗留”(carryover)污染。PCR去污染（decontamination）的措施停止试验，寻找污染源。抛弃所有可疑的试剂。工作区间彻底的清洁消毒。更换实验设备。改用另一对引物，扩增靶DNA的不同区域。PCR的基本步骤与污染的发生ReagentpreparationSpecimenpreparationAmplificationDetectionResultsCalculation预防污染的

5、措施建立标准的PCR实验室，将PCR的不同过程在不同的区间进行。为污染控制策略的核心部分。酶法防止PCR产物的遗留污染。表面紫外线照射减少PCR的污染。用化学加合物如异补骨脂素将单链或双链DNA衍生化，这些加合物可防止污染的DNA作为反应的底物。标准实验室的组成及其功能（1）前PCR区（Pre-PCRlaboratory）：又称试剂贮存与准备区，用于试剂的制备、分装、贮存以及配制PCR反应的“主混合物”反应混合物的成分Mg2+Mn2+dCTPdGTPdUTPdATPTaqDNA多聚酶rTthDNA多聚酶AmpErase生物素标记的引物和或和主混合物标准实验室的组成及其功能（2）标本处

6、理区（Sampleprocessinglaboratory）：标本的保存，目的核酸的提取、贮存，目的核酸的添加以及cDNA的合成。Mn2+AmpErase®rTthDNAPolymeraseBiotinylatedPrimersTargetRNAorDNAReverseTranscriptiondCTPdTTPdGTPdUTPdATPBiotinylatedAmpliconBiotinylatedAmplicon标准实验室的组成及其功能PCR扩增区（PCRamplificationlaboratory）：DNA或cDNA的扩增。PCR产物分析区（PCRproductanalysisla

7、boratory）：又称后PCR区，PCR产物的检测与分析。Step2.DenaturationandHybridisationDenaturationBSABSAAMPLICONAMPLICONDenaturedStrandsBiotinHybridisationCaptureProbelinkedtoBSAStep3.BindingofaAv-HRPConjugateandAdditionofSubstrate(Incubateat37C)