自身免疫性感音神经性聋豚鼠子代的内耳功能与形态学研究_1

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1、自身免疫性感音神经性聋豚鼠子代的内耳功能与形态学研究［摘要］目的:观察自身免疫性感音神经性聋雌性豚鼠子代内耳听觉生理功能及组织结构病理变化，探讨内耳自身免疫因素与子代内耳听觉损伤的相关性。方法:采用同种粗制内耳抗原免疫，造成雌性豚鼠ASNHL，妊娠后持续抗原强化免疫，对其所产子鼠进行相关指标测试和观察，包括听神经复合动作电位阈值、幅值和耳蜗微音器电位伪阈，血清抗CIEAgs抗体水平以及内耳病理形态学观察。结果:ASNHL雌鼠的子代36只中有18只出现听力损伤，血清抗CIEAgs抗体增高，螺旋神经节细胞变性，数目减少，蜗螺旋管内炎性细胞浸润。结论:ASNHL所产子

2、鼠可出现先天性感音神经性聋和内耳病理损伤，其发生可能与特异性体液免疫有关。［关键词］先天性感音神经性聋;自身免疫;内耳功能;豚鼠我国新生儿的先天性聋发生率为～，其中以先天性感音神经性聋居多。非遗传性CSNHL的病因主要有妊娠期病原微生物感染、使用耳毒性药物、高危妊娠等［1］，但仍有许多CSNHL原因不明。本项目组前期实验研究发现，实验性自身免疫性感音神经性聋豚鼠的子代中部分出现先天性聋［2］。本研究旨在通过观察自身免疫性感音神经性聋雌性豚鼠所产子代内耳听觉功能及组织结构病理变化，进一步探讨自身免疫因素导致先天性聋的作用及其机制。1对象和方法动物健康白化豚鼠70只

3、，由南京医科大学医学实验动物中心提供，雌性50只，雄性20只，体重400～450g，耳郭反射阳性，耳镜检查排除中耳疾患。1.实验方法实验设计将雌鼠随机分为两组，第1组40只，首次免疫每只按・-1粗制内耳抗原与等量完全弗氏佐剂乳化后于豚鼠右后足垫和背部多点皮下注射，以后每隔2周，采用・-1与等量不完全弗氏佐剂乳化后按上述方法强化免疫;第2组10只，用・L-1的PBS代替CIEAgs，免疫方法同第1组。免疫3次后进行听力测试，并以第2组听神经复合动作电位N1波阈值、幅值和各频率耳蜗微音器电位伪阈的均数加两倍标准差作为听力损伤的标准，任一指标异常判定为听力损伤，从而确

4、定第1组中产生的ASNHL模型动物共14只，交配妊娠后持续强化免疫，其子代36只作为实验组，第2组雌鼠的子代18只作为对照组。制备活体断头，显微分离并取出豚鼠膜迷路，经超声粉碎、匀浆、离心，取上清液，在紫外分光光度计下分别测280、260nm的吸光度，计算其蛋白含量，分装后低温干燥，制成干粉备用。耳蜗电图检测母鼠第3次免疫后2周、子鼠出生后2～3周进行。采用面神经管电极和Amplaidk12听觉诱发电位测试系统，刺激声信号为Click，重复频率为11次・s-1，记录cAPN1波阈值、幅值;采用、2、8kHz短纯音作为刺激声信号，记录CM伪阈。血清抗CIEAgs抗

5、体检测子鼠听觉电生理检测后取血清，采用酶联免疫吸附试验间接法进行检测。包被抗原为CIEAgs，一抗为1∶10稀释的豚鼠血清，二抗为辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌A蛋白，显色底物为邻苯二胺.过氧化氢溶液，检测波长为490nm的吸光度A值。颞骨火棉胶切片观察子鼠取血清后断头，取出听泡，经固定、脱钙、脱水、浸胶、包埋等制成火棉胶块，水平切片厚度为15μm。每一耳蜗取靠近蜗轴的3张切片，HE染色后光镜观察。螺旋神经节细胞计数按文献［3］方法，目镜加网格片，每小格在10×40放大倍数下覆盖10μm×10μm面积，只计算底回数目。1.统计学方法计量资料以ˉx±s表示，统计学处

6、理均采用t检验，以P结果.1内耳听觉功能实验组与对照组相比，cAPN1波阈值提高，幅值减小，各频率CM伪阈提高，差异均有显著性。见表1、2。表1子代豚鼠cAPN表2子代豚鼠各频率CM.血清抗CIEAgs抗体水平对照组血清抗体A值为±，实验组为±，两组对比，差异有显著性。.火棉胶切片光镜观察实验组镜下见螺旋神经节细胞变性，分布稀疏，胞核浓缩，蜗螺旋管内有炎性细胞浸润，毛细胞形态正常，未见明显膜迷路积水以及各腔阶出血等病理现象。对照组未见明显异常。实验组螺旋神经节细胞变性，数目减少，蜗螺旋管内有炎性细胞浸润图实验组螺旋神经节火棉胶切片底回螺旋神经节细胞计数均值为对照

7、组122±、实验组89±，后者较前者明显减少，差异有显著性。讨论在其他妊娠合并自身免疫病的研究中，许多学者对母体及胎儿体内的抗体进行了动态分析，发现母体内的特异性抗体可以进入胎儿体内，并且两者的抗体浓度呈正相关关系，即母体内的浓度高则胎儿体内的浓度亦高。Radetti等［4］报道了1例新生儿在宫内及出生后的甲状腺功能状况。其母亲患有Grave病合并桥本甲状腺炎，在妊娠晚期发展为甲亢，体内含高水平的抗甲状腺自身抗体，在21周时已发现TRAb经胎盘转运，此后，胎儿及母体的TRAb均上升。胎儿出生时，检测其体内的TRAb显示具有刺激性活性。根据Krude等［5］报道，

8、先天性甲亢最初见于母亲患