自身免疫性感音神经性聋豚鼠子代的内耳功能与形态学研究论文

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1、自身免疫性感音神经性聋豚鼠子代的内耳功能与形态学研究论文.freelmunesensorineuralhearingloss，ASNHL）豚鼠的子代中部分出现先天性聋［2］。本研究旨在通过观察自身免疫性感音神经性聋雌性豚鼠所产子代内耳听觉功能及组织结构病理变化，进一步探讨自身免疫因素导致先天性聋的作用及其机制。1对象和方法1.1动物健康白化豚鼠70只，由南京医科大学医学实验动物中心提供，雌性50只，雄性20只，体重400～450g，耳郭反射阳性，耳镜检查排除中耳疾患。1.2实验方法1.2.1实验设计将雌鼠随机分为两组，第1组40只，首次免

2、疫每只按0.4mg（0.4ml）-1粗制内耳抗原（crudeinnerearantigens，CIEAgs）与等量完全弗氏佐剂乳化后于豚鼠右后足垫和背部多点皮下注射，以后每隔2周，采用CIEAgs0.4mg（0.4ml）-1与等量不完全弗氏佐剂乳化后按上述方法强化免疫;第2组10只，用0.1molL-1pH7.4的PBS代替CIEAgs，免疫方法同第1组。免疫3次后进行听力测试，并以第2组听神经复合动作电位（cAP）N1波阈值、幅值和各频率耳蜗微音器电位（CM）伪阈的均数加两倍标准差作为听力损伤的标准，任一指标异常判定为听力损伤，从而确定

3、第1组中产生的ASNHL模型动物共14只，交配妊娠后持续强化免疫，其子代36只作为实验组，第2组雌鼠的子代18只作为对照组。1.2.2CIEAgs制备活体断头，显微分离并取出豚鼠膜迷路（包括基底膜、螺旋韧带、半规管、椭圆囊和球囊），经超声粉碎、匀浆、离心（1500rmin-1，5min），取上清液，在紫外分光光度计下分别测280、260nm的吸光度（A值），计算其蛋白含量，分装后低温干燥，制成干粉备用。1.2.3耳蜗电图检测母鼠第3次免疫后2周、子鼠出生后2～3周进行。采用面神经管电极和Amplaidk12听觉诱发电位测试系统，刺激声信号

4、为Click，重复频率为11次s-1，记录cAPN1波阈值、幅值;采用0.5、2、8kHz短纯音作为刺激声信号，记录CM伪阈。1.2.4血清抗CIEAgs抗体检测子鼠听觉电生理检测后取血清，采用酶联免疫吸附试验间接法进行检测。包被抗原为CIEAgs，一抗为1∶10稀释的豚鼠血清，二抗为辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌A蛋白，显色底物为邻苯二胺.过氧化氢溶液，检测波长为490nm的吸光度A值。1.2.5颞骨火棉胶切片观察子鼠取血清后断头，取出听泡，经固定、脱钙、脱水、浸胶、包埋等制成火棉胶块，水平切片厚度为15μm。每一耳蜗取靠近蜗轴的3张切片

5、，HE染色后光镜观察。螺旋神经节细胞计数按文献［3］方法，目镜加网格片，每小格在10×40放大倍数下覆盖10μm×10μm面积，只计算底回数目。1.3统计学方法计量资料以ˉx±s表示，统计学处理均采用t检验，以P0.05判断为差异有显著性意义。2结果2.1内耳听觉功能实验组与对照组相比，cAPN1波阈值提高，幅值减小，各频率CM伪阈提高，差异均有显著性（P0.01）。见表1、2。表1子代豚鼠cAPN（略）表2子代豚鼠各频率CM（略）2.2血清抗CIEAgs抗体水平对照组血清抗体A值为0.1628±0.0357，实验组为0.5150±0.2

6、444，两组对比，差异有显著性（P0.01）。2.3火棉胶切片光镜观察实验组镜下见螺旋神经节细胞变性，分布稀疏，胞核浓缩，蜗螺旋管内有炎性细胞浸润（图2），毛细胞形态正常，未见明显膜迷路积水以及各腔阶出血等病理现象。对照组未见明显异常。实验组螺旋神经节细胞变性，数目减少，蜗螺旋管内有炎性细胞浸润图2实验组螺旋神经节火棉胶切片（略）底回螺旋神经节细胞计数均值为对照组122±1.25、实验组89±2.36，后者较前者明显减少，差异有显著性（P0.01）。3讨论在其他妊娠合并自身免疫病的研究中，许多学者对母体及胎儿体内的抗体进行了动态分析，发现

7、母体内的特异性抗体可以进入胎儿体内，并且两者的抗体浓度呈正相关关系，即母体内的浓度高则胎儿体内的浓度亦高。Radetti等［4］报道了1例新生儿在宫内及出生后的甲状腺功能状况。其母亲患有Grave病合并桥本甲状腺炎，在妊娠晚期发展为甲亢，体内含高水平的抗甲状腺自身抗体（TRAb），在21周时已发现TRAb经胎盘转运，此后，胎儿及母体的TRAb均上升。胎儿出生时，检测其体内的TRAb显示具有刺激性活性。根据Krude等［5］报道，先天性甲亢最初见于母亲患Grave病的婴儿，母体的TRAb经胎盘转运至胎儿，引起胎儿及新生儿甲亢，称为自身免疫性

8、先天性甲亢。目前研究发现，内耳具有发生免疫应答的解剖结构和细胞成分，有针对特异性抗原发生局部免疫反应的能力［6］。局部的免疫炎性反应可导致明显的听觉或前庭功能障碍以及内耳免疫病理损伤，ASNH