脊髓损伤基因治疗的研究进展

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1、脊髓损伤基因治疗的研究进展关键词：脊髓损伤基因治疗1990年美国首次成功地进行腺苷脱胺酸缺乏的基因治疗以来，基因治疗已成为当前生物医学中进展最快的领域之一［1］。基因治疗在脊髓损伤后轴突再生中亦可望成为有效的手段之一［2—5］。利用外源基因在靶细胞中的表达，以改变神经元某些内在特性，从而进一步探索sCI后神经元的存活能力，再生特性和功能恢复的分子机理，最终为sCI的治疗探讨新途径是目前治疗sCI的研究方向。它有助于把sCI治疗提到一个新的水平。值得我们进一步研究。一、sCI基因治疗有关分子生物学基础基因转移是实现基因治疗的关键技术［6］。因此，基因治疗的首要步骤是转导基因的

2、分子构建。一般转导基因由目的基因cDNA，启动子／增强子和载体三部分组成。目的基因重组时除本身特有的序列外，通常还需进行必要的修饰，如转录起始修饰，翻译起始，内含子和聚腺苷酸化信号等的修饰。用于重组的启动子／增强子，一般有三种：强组成型，管家型，及组织持异型启动子，其中最常用为第一型［7］。理想的体内基因转移载体要求：转移具有细胞靶向性，导入基因的表达可调控，而且转移的方法简便易行。用于sCI的基因转移载体主要是逆转录病毒载体，即乳腺病毒、莫罗尼小鼠白血病病毒和劳斯肉瘤病毒等。构建转录病毒载体的基本原理是：病毒的长末端重复序列可以对插入的外源基因进行有效转录，这样先在体外构

3、建反转录病毒前病毒dNA载体，即酶切去除基因组中的反式作用区域，产生缺陷型的反转录病毒，这种病毒只具有控制感染和整合的序列。缺陷型病毒载体必须依赖包装细胞提供的蛋白质才能完成包装，产生带有外源基因的伪病毒。它能感染受体细胞，载体dNA将依靠其lTR整合入受体细胞染色体基因组，这样外源基因被带入宿主细胞并得以表达［2、3、6、7］。逆转录病毒载体感染率高，最常用于体外间接基因治疗，其缺点是要求靶细胞必须有增殖和分裂特性［8］。此外，cao［9］等研究用阳离子脂质体直接注入cNS作基因转移获得成功。但因阳离子脂质体对cNS有毒性，故目前致力于发展非病毒技术，一种阳离子多聚体一聚

4、乙烯亚胺业已用于基因转移［10］。另有selle［6］等报道的复制缺陷腺病毒也是一种适用于神经系统的理想载体。在sCI治疗中，由于受体细胞要植入脊髓内，因此所用受体细胞应当符合一定的标准［4、6］：①容易获取和繁殖；②移植后能长期存活且能继续分裂和具有活力。③无免疫源性及形成肿瘤的危险。目前已用于sCI试验有雪旺氏细胞和成纤维细胞［2、3、11］。此外，肌母细胞也是具有应用前景的较好受体细胞，研究表明肌母细胞转移至cNS至少可活6个月，且无肿瘤源性［12］。基因治疗的实施，有赖于将目的基因准确、高效地转入靶细胞，并使之安全，高效和可控地表达。基因治疗中基因转移的策略主要有两

5、种，即活体外法和在体法。活体外法就是在体外先对适当细胞进行遗传修饰，使其表达和分泌特定的重组蛋白，然后将修饰细胞移植入活体神经组织，通过神经递质替代或神经营养因子和／其它治疗因子的引入恢复正常的神经功能。这种方法尤其适于因缺乏nTF或神经递质前体分子等可扩散物质所致的cNS疾病。如帕金森氏病及cNS损伤。在体法是利用适当的重组病毒或化学基因转移载体将目的基因及有治疗作用的重组蛋白直接转移，效率较低，故较少采用。此外，活体外法可采用自体的工程细胞移植，在体外可对高表达细胞克隆进行筛选，有效的控制移植细胞的数量和质量，应用立体定位和成像技术可以将工程细胞十分准确地移植到cNS特

6、定的区域内，以保证在局部产生高浓度的治疗因子。二、基因治疗sCI的现状和展望基因治疗sCI尚处于实验探索阶段。目前，主要是采用nTF基因修饰雪旺氏细胞或成纤维细胞后再将其植入鼠的脊髓损伤区，观察其轴突再生的情况［2、3、11］。tuszyski［11］将nGF基因导入培养的sC内，再将sC移植到损伤的脊髓，发现sC在体内能稳定地表达nGF并促进轴突的再生。同年tuszynski等［2］利用来源于莫洛氏鼠白血病的逆转录病毒载体，将人的nGF基因导入鼠成纤维细胞中，再将成纤维细胞移植到半横贯损伤的鼠脊髓中。1年后成纤维细胞仍能表达nGF，电镜及免疫组化检查，发现有大量的脊髓轴突

7、再生。1996年，tuszynski等［3］采用同样方法，又将nGF基因导入成纤维细胞中，并将其移植到半横断损伤的鼠脊髓中，14月后，通过rT—pCR技术鉴定成纤维细胞仍表达nGF。电镜、免疫组化检查发现有大量的轴突再生。作者在国际上首次构造po—5＇—flanking介导的髓鞘碱性蛋白微基因的基础上，通过阳离子脂质体导入sC中，然后再将基因修饰的sC移植入成鼠半横断损伤脊髓，观察其对sCI的再生修复作用，现已发现pSVPoMcat微基因修饰sC对sCI后细胞凋亡有抑制作用［13］。当然利用基因转移技术治疗sCI，