2013苏教版选修1第一节《生物成分的分离与测定技术》word学案

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1、第四章生物化学与分子生物学技术实践4.1生物成分的分离与测定技术（蛋白质的分离与纯化）探究目的：1、体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法2、了解电泳法分离生物大分子的基本原理探究预习：实验操作程序(1)样品处理①红细胞的洗涤：除去血浆蛋白等杂质，有利于后续步骤的分离纯化；②血红蛋白的释放：使红细胞破裂，血红蛋白释放出来；③分离血红蛋白溶液：经过离心使血红蛋白和其他杂质分离开来，便于下一步对血红蛋白的纯化。(2)粗分离①原理：透析袋能使小分子自由出入，而将大分子保留在袋内，透析可以除去样品中分子

2、质量较小的杂质。②过程：取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12h。③目的：④图示：⑤注意：透析时间为12h。透析袋是用硝酸纤维素制成，小分子可自由进出，而大分子保留在袋内。(3)纯化：一般采用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离和纯化。(4)纯度鉴定：一般用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，来测定蛋白质的分子量，即对血红蛋白进行纯度鉴定。3．结果分析与评价【解读步骤】(1)红细胞的洗涤①采集血样→②低速短时间离心→③吸

3、取血浆→④盐水洗涤→⑤低速离心→⑥重复④⑤步骤三次。特别提醒(1)洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，以利于后续步骤的进行。(2)离心时转速要低，时间要短，一般为500r/min，离心2min。(3)洗涤三次后，如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数。(2)血红蛋白的释放将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再加40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10min。在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。(3)分离血红蛋白溶液将搅拌好的混合液转移到离心管中，以2000r/min的速度离心1

4、0min后，试管中的溶液分为4层：第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）特别提醒(1)将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层。(2)将滤液于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的血红蛋白水溶液层。(4)透析取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12h。目的是除去样品中相对分子质量

5、较小的杂质。2．凝胶色谱操作(1)凝胶色谱柱的制作①取长40cm，内径为1.6cm的玻璃管，两端需用砂纸磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。⑤安装其他附属结构。特别提醒底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。(2)凝胶色谱柱的装填(本实验使用的凝胶是交联葡聚糖凝胶)①固定：将色谱柱垂直固定在支架上 ②装填：将凝胶

6、悬浮液一次性装填入色谱柱内③洗涤：用磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12h(3)样品的加入和洗脱①调整缓冲液面：与凝胶面平齐 ②滴加透析样品：用量为1mL ③样品渗入凝胶床：样品完全渗进凝胶层 ④洗脱：打开下端出口，用磷酸缓冲液洗脱 ⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集特别提醒(1)滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。(2)在蛋白质分离过程中，仔细观察红色区带在洗脱过程中的移动情况。如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功。材

7、料用具：猪、牛、羊或者其他脊椎动物的血液，离心管，透析袋，凝胶色谱柱，聚丙烯酰胺凝胶电泳的装置等。探究过程（）：探究步骤探究记录结论或解释1.配制试剂选择相应的化学试剂，配制巴比妥缓冲液、染色液、漂洗液、透明液等。配制巴比妥缓冲液（pH8.6）1000mL（巴比妥2.76g，，巴比妥钠15.45g，加蒸馏水定容至1000mL）；配制染色液100mL（氨基黑l0B0.25g，甲醇50mL，冰醋酸10mL，蒸馏水40mL）；配制漂洗液100mL（甲醇或乙醇45mL，冰醋酸5mL，蒸馏水50mL）；配制透明液

8、100mL（无水乙醇:冰醋酸=7:3）。2.架滤纸桥按照支架的大小裁剪合适的滤纸条，取双层滤纸条，一端与支架前沿对齐，另一端浸入电泳槽的缓冲液，待滤纸条湿润后，驱除气泡，使滤纸紧贴于支架上，即是滤纸桥。3.浸泡薄膜用镊子夹取醋酸纤维薄膜，识别出光泽面，并在光泽面的一角用笔做上记号，然后放在巴比妥缓冲液中浸泡20min。4.细心点样取出薄膜，吸去多余的液体，平铺在玻璃板上，有记号的一面朝下。点样时用盖玻片在血清中蘸一下，在离薄膜一端2~3cm