生化技术_课件 第一章 生命大分子物质的制备课件

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1、第一章生命大分子物质的制备生物大分子 (biomacromolecule)通常是指动物、植物和微生物在进行新陈代谢时产生蛋白质和核酸等有机化合物的总称。特点：具有较大的分子量、由简单的小分子排列组成、具有复杂的空间结构、生物大分子的生物活性由结构决定。阐明生物大分子复杂的结构及结构与功能的关系是生物学的主要任务。在自然科学，尤其是生命科学高度发展的今天，蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘的中心课题。生物大分子结构与功能的研究，必须首先解决生物大分子的制备问题，没有能够达

2、到足够纯度的生物大分子的制备工作为前题，结构与功能的研究就无从谈起。生物大分子的分离纯化与制备是一件十分细致而困难的工作。生物大分子的制备有以下主要特点：与化学产品的分离制备相比较：⑴蛋白质的组成、结构极其复杂，分子差异大导致分离、纯化和鉴定有难度和特殊性；核酸较之要简单。⑵通常以复合物的形式存在，提取分离困难。⑶许多生物大分子离开了生物体环境就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，是生物大分子提取制备最困难之处。⑷许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯化的步骤繁多，流程长。⑸生物材料的组成

3、极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物，方法的通用性较差。正是这些特点致使蛋白质的分离纯化和分析的难度极大。①在水和各种有机溶剂中的溶解性。②在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性。③各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数。首要了解生物大分子的理化性质：④固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。⑤其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。⑥对其他生物分子的特殊亲和力。蛋白质的理化

4、性质蛋白质的两性电离和等电点蛋白质的胶体性质蛋白质的变性、复性、沉淀和凝固蛋白质的紫外吸收目前纯化蛋白质等生物大分子的关键技术是电泳、层析和离心三大技术。材料的选择与处理第一节制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。材料的来源无非是动物、植物和微生物及其代谢产物。所选用的材料主要依据实验目的来确定。选择的材料应含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低。一、材料的选择有效成分：指欲纯化的某种单一的生命大分子物质。杂质：有效成分以外的其他物质的统称。例一：胰岛素的提取含量：牛胰腺>猪胰腺来源：猪>牛成本

5、：牛>猪综合结果：选用猪胰腺作为材料。例二：酸性磷酸酶分离纯化与活性测定含量：小麦的胚芽中含量高材料尽可能保持新鲜，尽快加工处理，以防有效成分降解、破坏，必要时可冷冻、干燥处理。1、动物组织必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理后在适当的溶剂中提取，如果所要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。二、材料的处理冰冻-70℃保存备用较好干燥2、植物材料必须清洗,去壳，脱脂，并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。如叶片:直接洗净植物

6、种子:泡胀或粉碎3、微生物：种类多，繁殖快、培养简便、易诱变、不受季节的影响，是常用的材料。应注意它的生长期。在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量。以微生物为材料时有两种情况：（1）微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等（2）菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存；对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备；第二节确立测定方法一、目的与要求生物大分子的两个重要特征：极易失活和含量极微测定方法应该：简便、灵敏、准确、快速

7、、专一分析测定的方法主要有两类：即生物学和物理化学的测定方法。生物学的测定法主要有：酶的各种测活方法、蛋白质含量的各种测定法、免疫化学方法、放射性同位素示踪法等；二、常用的测定方法物理、化学方法主要有：比色法、气相色谱和液相色谱法、光谱法（紫外／可见、红外和荧光等分光光度法）、电泳法、以及核磁共振等。实际操作中尽可能多用仪器分析方法，以使分析测定更加快速、简便。1、光谱法不同的生命大分子物质与相应波长的光会发生特定的作用，依据作用结果可推断出被测物质的含量和部分理化性质，这类测定方法为光谱法。所需的

8、样品量少、操作简单、反应迅速、灵敏广泛用于物质的含量测定。紫外光谱法、可见光光谱法、荧光光谱法、浊度法紫外光谱法利用某些生物大分子具有吸收紫外光的性质而建立的一种方法。将一定浓度的待测物溶液，通过某一特定波长的紫外分光光度计，测定此溶液的消光值即可换算出待测物的浓度。1.测定核酸含量2.测定蛋白质的含量及纯度芳香族氨基酸的紫外吸收测定核酸蛋白质的含量:OD260=1.0相当于50μg/ml双链DNA40μg/ml单链DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸测定核酸