生物化学技术1生命大分子物质的制备

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1、第一章生命大分子物质的制备生命大分子物质是指动物、植物和微生物在进行新陈代谢时所产生的蛋白质(包括酶)和核酸等有机化合物的总称蛋白质和核酸类物质是本学科的主要研究对象，而它们往往与其他物质结合在一起，或蛋白质和核酸相互组合而一起出现，加之它们含量低、离体后稳定性较差，使得提取分离过程变得困难；尽管如此，制备生命大分子物质的程序还是存在不少共同之处目的掌握材料的选择与处理及确立测定方法掌握细胞的破碎、抽提、浓缩熟悉纯化方案的设计与评价第一节材料的选择与处理一、材料的选择是指欲纯化的某种单一的生命大分子物质有效成分的定义生物材料的特点有效

2、成分含量一般较低有效成分稳定性较差选用的材料不同，有效成分的含量就不同；即使选用的材料相同，不同的部位和生长时期，其有效成分的含量也不尽相同材料选择原则有效成分含量高，稳定性好材料来源丰富，保持新鲜提取工艺简单有综合利用价值实际工作中，不能硬套原则，要视实际情况而定二、材料的处理对于生物材料，应及时使用，否则有效成分会部分甚至全部被破坏，影响得率若处理不当，会严重影响有效成分的产量和质量（一）动物脏器◆冰冻：去除脂肪和筋皮等非有效部位，-10℃或-70℃冰冻储存◆干燥：◇小量（如垂体等小组织）可用丙酮脱水干燥◇对于耐高温的有效成分（肝

3、素），其材料可用沸水蒸煮处理，烘干后保存除脂方法人工剥离用脂溶性有机溶剂脱脂热处理冷藏法（速热到50℃左右，然后速冷却），使其结块而除去运用油脂分离器分离（二）植物组织茎叶等洗净即可使用，或快速放置-4~30℃储藏备用；若为种子，则需泡胀或粉碎才使用（油脂较多的也需脱脂处理）（三）微生物由于具有种类多、繁殖快、培养简单、诱变容易和不受季节影响等优点，现已成为制备生命大分子物质的主要材料之一上清：制备胞外酶和辅基等成分培养液离心菌体：破壁后提取胞内成分第二节确立测定方法一、目的要求目的：1.确定生物材料2.确定提取纯化方法的有效性要求：

4、方法简单、灵敏、专一性强（因为抽提液和纯化的前阶段溶液中有效成分的比活低而杂质的种类多且含量高）常用的测定方法光谱法：包括吸收光谱法、荧光法、浊度法电化学法生物活性检测法免疫分析法生物传感器（一）光谱法特点：所需样品量少，操作简单，反应迅速，灵敏（10-7）。广泛用于蛋白质含量的测定1.吸收光谱法直接测定：将待测物配成一定浓度的溶液，在一定波长处用分光光度计测定其含量如测定核酸含量：双链DNA：50μg/ml；单链DNA：３７μg/ml；单链ＲNA：４０μg/ml；A260=1纯度测定:纯DNAA260/A280=1.8;纯RNAA2

5、60/A280=2.0(若DNAA260/A280<1.8或<2.0,说明有蛋白质混入)比色法:将待测物与相关试剂或酶的底物作用产生具有特定颜色的物质,通过测定有色物质的A值对待测物定量或测定酶的活性2.荧光法特点：精确、灵敏（10-9~-10）、重复性好如AST的测定：ASP+α-酮戊二酸草酰乙酸+Glu草酰乙酸+NADH+H+L-苹果酸+NAD+AST活力测定就是通过测定在340nm（NADH）处的A值下降量ASTMDH3.浊度法主要对稀悬浮液进行测定如：半刀豆球蛋白活力测定—A420培养液中细菌浓度测定—A600（二）电化学法用

6、pH计或酸碱滴定进行测定（三）生物活性检测法根据生命活性物质用于实验动物身上引起的变化对生命活性物质进行检测如：HCG能使小鼠子宫加速增殖，故通过注入HCG后检测小鼠子宫的变化来推测HCG的生物活性（四）免疫分析法利用Ag-Ab特异反应，并结合放射性同位素标记或酶标记，对有关物质灵敏定性或定量如：酶联免疫吸附法（五）生物传感器利用生物传感器的敏感膜与待测液中某一成分进行反应，来显示有效成分的数量几种测定蛋白质和核酸含量的方法第三节细胞的破碎有效成分有的存在于“材料”细胞外，有的存在于细胞内。就原核细胞而言，若有效成分分泌到细胞外（如淀

7、粉酶类、水解酶类），则分离培养液上清，用相应试剂和方法即可提取制备；若有效成分存在于细胞内（如氧化还原酶类），则需破碎细胞，再进行提取但也有例外，如从铜绿假单胞菌中提取ALP时，可不破细胞，用0.2mol/LMgCl2的0.01mol/LTris-HCl缓冲液（pH8.4）或0.2mol/LMgCl2的溶液（pH8.4）进行抽提（提取酶蛋白后的细菌细胞，可继续培养）一般动物脏器的细胞膜比较脆弱，极易破碎，往往在组织绞碎或提取时就破坏了，而植物和微生物的细胞壁较牢固，需提前进行专门的破细胞操作常用方法机械破碎（研磨法、组织器捣碎法、超声

8、波法、压榨法和冻融法）溶胀和自溶化学处理生物酶降解一、机械破碎1.研磨法：将剪碎的动物组织置研钵中，用研磨棒研磨。为提高研磨效率，也可加入一定量的石英砂（注意“吸附”）。大规模生产时，可用电动研磨法（如球磨机）此法为温和