《生物大分子的制备》PPT课件

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1、生物大分子的制备技术蛋白质、核酸的分离和提纯研究生物大分子，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。基本原理不外乎两方面：一是利用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离的目的，如电泳、超速离心、超滤等。而在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、碱、高温及剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。生物大分子的制备一般分为以下四个

2、阶段：①选择材料和预处理；②细胞的破碎及细胞器的分离；③提取和纯化；④浓缩干燥和保存。第一节选择材料及预处理选材：微生物、植物和动物都可作为制备生物大分子的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。（一）微生物微生物应该注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量。以微生物为材料时有两种情况1、利用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；2、利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。（二）植物材料植物材料必须经过去壳、脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中

3、所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。（三）动物组织动物组织用有效成分含量丰富的脏器组织为原料，先进行绞碎、脱脂等处理。另外，对于处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存。对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。第二节细胞的破碎及细胞器的分离一、细胞的破碎1、高速组织捣碎机捣碎此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。2.玻璃匀浆器匀浆此法对细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用量少的动物内脏组织。3.反复冻融法将细胞在－20℃以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的

4、盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。4.化学处理法有些动物细胞，如：肿瘤细胞可采用十二烷基硫酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等使细胞膜破坏。如果细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。5、超声波处理用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧振荡破碎。此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用菌体质量浓度为50－100mg/ml，在10－100KHz频率下处理10－15min。此法的缺点是在处理过程中会产生大量的热能，应采取相应降温措施。对超声波敏感的酶和核酸应慎用。细胞器名称主要蛋白和酶核酸细胞核精蛋

5、白、组蛋白、核酸合成酶系全部的DNA和RNA10％线粒体电子传递、氧化磷酸化、三羧酸循环、微量DNA，总RNA脂肪酸的氧化、氨基酸氧化等5％－10％内质网（微粒体）蛋白质合成酶系、羟化酶类总RNA50％溶酶体水解酶系（核酸酶、磷酸酯酶、组织蛋白酶及糖苷酶）高尔基体糖苷转移酶、粘多糖类固醇合成酶细胞膜载体与受体蛋白、特异抗体、ATP酶、环腺苷酶、葡萄糖6－磷酸酶细胞液嘧啶与嘌呤代谢、氨基酸合成酶系、RNA（主要是tRNA可溶性蛋白类占50％）二、细胞器的分离各类生物大分子在细胞内的分布是不同的。一般采用差

6、速离心法。第三节提取和纯化提取是将经过处理或破碎的细胞，置于一定的条件和溶液中让被提取的生物大分子充分释放出来的过程。影响提取的因素主要是被提取物质在提取的溶液中溶解度的大小及由固相扩散到液相的难易程度。某一物质在溶剂中溶解度大小与该物质的分子结构及溶剂理化性质有关，一般遵守相似相溶的原则。一、蛋白质的提取（包括酶）、pH蛋白质和酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH应选择在偏离等电点两侧的pH范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化。从而导致蛋白构象的不可逆变化。一

7、般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液提取。盐浓度稀盐溶液可促进蛋白的溶解，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量Nacl等中性盐，一般以0.15mol/L浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05mol/L磷酸盐或碳酸盐的等渗盐溶液。一、蛋白质的分离纯化（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法1.蛋白质的盐析中性盐对蛋白质的溶解度有显著的影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度的升高，蛋白质的溶解度增加，称为盐溶；当盐浓

8、度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称为盐析。血浆蛋白质的分段盐析硫酸铵的饱和度g.(100mlH2O)-1沉淀的蛋白质20纤维蛋白48－33r球蛋白40－46a球蛋白>50清蛋白蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的是硫酸铵，它的优点是硫酸铵分段盐析效果也比其它盐好，不易引起蛋白质变性。蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析。此外也可用葡聚