生物工程综合实验

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1、生物工程综合大实验木聚糖是存在于植物细胞壁中最丰富的半纤维素，其化学结构较纤维素复杂得多，它是一个以β-1,4-糖苷键相连的木聚糖主链上带着一些不同的取代基如乙酰基、阿拉伯糖基、4-O-甲基葡萄糖醛酸和阿魏酸残基等而构成的。Endo-β-1,4-木聚糖内切酶（EC3.2.1.8）简称木聚糖酶，是木聚糖降解过程中最关键的一个酶，也是被研究最多的一个半纤维素酶，随机水解木聚糖主干链内部的β-1,4-糖苷键，产生木寡糖、木二糖和少量木糖。木聚糖酶在造纸工业、饲料工业、食品工业、低聚木糖的制备等领域具有重要应用价值。本实验主要以携带有编码极端耐热木聚糖酶基因的重组质粒的大肠杆菌工程菌（JM109-p

2、Hsh-xynB）为对象，利用它进行重组酶的发酵生产和分离纯化。通过此次实验，希望同学们能对微生物发酵产酶的一般过程、酶活性的测定、酶的提取和分离纯化有一个基本的认识和了解。Ø实验一木糖-吸光度标准曲线、蛋白质浓度-吸光度标准曲线制作在研究酶的性质、酶的发酵生产、分离纯化和应用中需要经常测定酶的活性，为了较准确的表示酶活力，必须建立一种简便灵敏的酶活性测定方法。在酶的分离纯化和酶学性质研究中，经常要测定酶蛋白质的含量。Bradford法是一种迅速可靠的通过染色法测定溶液中蛋白质浓度的方法。1、实验目的掌握木糖标准曲线和Bradford标准曲线的制作方法2、实验原理木聚糖酶的活性通常是测定其水

3、解底物木聚糖后生成的产物的还原末端——木糖的增加量来进行的，而木糖的含量可以利用其与某些显色试剂（如DNS试剂，PAHBAH）反应后生成在特定波长下有特异吸收峰的有色化合物，从而通过分光光度法测出。本实验中，木聚糖酶活性的测定是以0.5%燕麦木聚糖为底物，利用对羟基苯甲酸酰肼（PAHBAH）与水解反应产生的还原糖反应生成的化合物在沸水浴中显现出黄色，这种化合物在410nm有最大的吸光值，化合物颜色的深浅与产物还原糖的多少有关，因此可检测410nm的光吸收值的大小计算酶活。用分光光度法测定木聚糖水解产物还原糖的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出还原糖的含量，最后根据产物的含量就可以计

4、算出酶的活性。因此，制作标准曲线是酶活性测定的一项基本技术。Bradford法是基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速稳定，反应化合物在465～595nm有最大的吸光值，化合物颜色的深浅与蛋白质浓度的高低成正比关系。因此可检测595nm的光吸收值的大小计算蛋白质的含量。同样，测定某一种蛋白质的浓度时，也要先用已知浓度的一种蛋白质制作标准曲线，然后根据标准曲线查出待测蛋白质的浓度。123、试剂①标准木糖溶液：准确称取经105℃烘至恒重的无水木糖1g,用蒸馏水定容至100ml(即1%)，实际

5、应用时稀释到0.01%②邻苯二甲酸氢钾缓冲液：准确配制0.1MpH5.8(90℃)的邻苯二甲酸氢钾缓冲液500ml，利用pH计以NaOH调节到规定铺pH值③终止剂/显色剂PAHBAH：A:0.5MHCl溶解的5%（w/v）对羟基苯甲酸酰肼（p-hydroxybenzoicacid）200ml，配好后储藏于4℃冰箱B:0.5MNaOH1L使用时，将A与B按1：4的体积比混合即为PAHBAH显色剂④Bradford储存液：100ml95%乙醇，200ml85%磷酸，350mg考马斯亮蓝G-250可在室温下长期保持稳定⑤Bradford工作液：425ml双蒸水，15ml95%乙醇，30ml85%磷

6、酸，30mlBradford储存液滤纸过滤后保存于室温棕色瓶中⑥标准蛋白质溶液:以牛血清白蛋白(BSA)作为标准蛋白，配制成1mg/ml标准溶液，用时可稀释。4、器材分光光度计、、电子天平、水浴锅、煮沸电炉、移液管、泡沫浮子若干、pH计、磁力搅拌器冰水5、实验步骤：A.木糖标准曲线的制作木聚糖酶活性的测定是以0.5%燕麦木聚糖为底物，利用对羟基苯甲酸酰肼（PAHBAH）与水解反应产生的还原糖的显色反应进行比色，具体方法是：反应体系为600µl，添加15µl酶液到由300µl0.5%（w/v）燕麦木聚糖和285µl100mMpH5.8的邻苯二甲酸氢钾缓冲液组成的已经在90℃下预热的混合液中，9

7、0℃下保温10min后，最后加入1.8mL终止剂/显色剂PAHBAH终止反应。其混合物在沸水浴中加热10min后，在冰水浴中冷却，用分光光度计在410nm下测其吸收值。木聚糖酶活性单位定义为每分钟催化产生1µmol木糖所需的酶量。在制作木糖标准曲线时，整个体系组成也应该与实际测定酶活性的条件一致。具体地说，在配制标准曲线时，整个体系应为：0.6mL溶液（0.3mL100mMpH5.8的邻苯二甲酸氢钾缓冲液+x