益心巴迪然吉布亚颗粒微生物限度检查法验证试验

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1、芜湖绿叶制药有限公司验证报告益心巴迪然吉布亚颗粒资料项目名称：微生物限度检查方法验证试验资料试验单位：芜湖市食品药品检验所试验方法起草人：联系电话：0553-5852117芜湖市食品药品检验所起草芜湖绿叶制药有限公司验证报告益心巴迪然吉布亚颗粒微生物限度检查法验证试验目的：确认对供试品微生物限度检查时，所采用的细菌、霉菌和酵母菌计数方法和控制菌检查方法是否适合于该品种的微生物限度检查。1.样品益心巴迪然吉布亚颗粒（生产单位：芜湖绿叶制药有限公司、批号：100346）2.验证用菌株大肠埃希菌[CMCC(B)44102]第2代、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]第2代、枯草芽孢

2、杆菌[CMCC(B)63501]第2代、白色念珠菌[CMCC(F)98001]第2代、黑曲霉[CMCC(F)98003]第2代。以上菌种均购自中国药品生物制品检定所。3.方法《中国药典》2010年版一部附录微生物限度检查方法验证试验。验证试验进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌的回收率。4.具体操作方法4.1供试液制备：取益心巴迪然吉布亚颗粒10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，振摇溶解，作为1：10的供试液，再用上述稀释液稀释成1：102稀释级，备用。4.2菌液制备(1)接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至80ml营养肉汤培养基中，3

3、5℃培养18小时，用0.9%无菌氯化钠溶液分别稀释至10-4、10-4、10-7，制成1ml含菌数为50-100cfu的菌悬液，做活菌计数备用。(2)接种白色念珠菌的新鲜培养物至80ml改良马丁培养基中，培养18小时，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至10-8，制成1ml含菌数为50-100cfu的菌悬液，做活菌计数备用。(3)取25℃培养7天的黑曲霉改良马丁琼脂斜面培养物，加15ml0.9%无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子。吸取出1ml孢子悬液，然后用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至10-6，制成每1ml含菌数为50-100cfu的菌悬液，做活菌计数备用。4.3细菌、霉菌、酵母菌平皿法计数验证

4、(1)试验组平皿法计数，分别取试验用的1：10、1：102芜湖市食品药品检验所起草芜湖绿叶制药有限公司验证报告供试液1ml和1ml含50-100cfu试验菌（大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌）的菌悬液，分别注入平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，35℃，3天培养；分别取试验用的1：10、1：102供试液1ml和1ml含50-100cfu试验菌（白色念珠菌、黑曲霉）的菌悬液，分别注入平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，25℃，5天培养。每株试验菌平行制备2个平皿，观察并记录菌落数，菌落计数见表1。表1试验组菌落计数（cfu/ml）药品批号100346100346100346大肠埃

5、希菌10-153；5358；6252；5310-248；5550；6147；59金黄色葡萄球菌10-155；6557；6371；7210-260；6169；6560；67枯草芽孢杆菌10-164；5963；6253；5810-257；5361；5754；52白色念珠菌10-161；6161；5956；5810-254；5460；5456；58黑曲霉10-152；4550；5352；4010-255；5249；6054；52(2)菌液组平皿法计数，取1ml含50-100cfu试验菌（大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉）的菌悬液，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培

6、养基，其中大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌倾注营养琼脂培养基，35℃，3天培养；白色念珠菌、黑曲霉倾注玫瑰红钠琼脂培养基，25℃，5天培养。每株试验菌平行制备2个平皿，测定所加试验菌数，观察并记录菌落数，菌落计数见表2。表2菌液组菌落计数（cfu/ml）大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉51；6162；7173；7060；5756；56(3)供试品对照组取规定量供试液测定供试品本底菌数，取1：10、1：102益心巴迪然吉布亚颗粒供试液1ml，加入平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，35℃培养3天；取1：10、1：102金果饮1ml，加入平皿中，立即倾注玫瑰红钠

7、琼脂培养基，25℃培养5天，每个稀释级供试液平行制备2个平皿，观察并记录结果。菌落计数见表3。表3供试品对照组菌落计数（cfu/ml）药品批号100346100346100346细菌10-12；13；10；010-20；10；00；1霉菌及酵母菌10-10；00；00；010-20；00；10；0芜湖市食品药品检验所起草芜湖绿叶制药有限公司验证报告回收率计算：回收率=×100%试验组菌的回收率见表4。表4试验组菌的回收率(%)药品批号10034610034610034