脂肪干细胞在体外长期传代后成软骨成骨能力变化的研究

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1、中山大学硕士学位论文脂肪干细胞在体外长期传代后成软骨成骨能力变化的研究姓名：索明环申请学位级别：硕士专业：干细胞与组织工程学指导教师：张志光20080530中山大学硕士学位论文脂肪干细胞在体外长期传代后成软骨成骨能力的变化研究脂肪干细胞在体外长期传代后成软骨成骨能力变化的研究专业硕士生导师干细胞与组织工程学索明环张志光教授中文摘要临床上，组织的损伤非常常见，其修复是个难题。组织工程学的提出给组织修复带来了曙光。组织工程学至少包括三个因素：种子细胞、支架材料、细胞因子。其中种子细胞是重要的因素之一，它包括胚胎干细胞和成体干细胞。而胚胎干细胞的应用存在很多的伦

2、理问题，成体干细胞就成为组织工程种子细胞的重要来源。脂肪干细胞是来自脂肪组织问充质的一种成体干细胞，在体外可长期传代，自我更新，并可以向多胚层分化。并且脂肪组织含量丰富，分布广泛，取材容易，脂肪干细胞容易分离获取，近年来它成为研究的热点，有望成为组织工程良好的种子细胞。成体干细胞在体外长期传代会逐渐失去它的表型，细胞特性发生变化。脂肪问质干细胞在体外长期传代后同样存在着这个问题。但是细胞要经过体外的传代培养才能达到足够的细胞量。故脂肪干细胞在体外长期传代后生物学特性的变化值得研究。软骨损伤可导致疾病，给病人造成很大的痛苦。而软骨很难自我再生和重建，因其没有

3、血供，并缺乏具有自我修复能力的细胞。软骨组织工程的提出为软骨的修复带来了曙光。在一定的条件下诱导脂肪干细胞诱导成软骨已经成为事一I一中山大学硕士学位论文脂肪干细胞在体外长期传代后成软骨成骨能力的变化研究实。经过体外长期传代后脂肪干细胞成软骨性能的变化成为研究的必要。骨组织可以自我修复，但是也存在难于愈合的骨损伤性疾病，Ll-,女n长骨的大面积缺损，粉碎性骨折。这就严重影响了病人的行为和生活质量。人们希望组织工程骨能够替代或者帮助修复这种类型的骨组织损伤。脂肪干细胞在体外可以诱导成骨，有很多实验已经证实。但是经过长期传代的脂肪干细胞成骨性能的变化是研究上的一

4、个空白。小型猪的解剖结构和人非常相似，有望成为组织工程器官移植的良好实验动物。所以本实验采用中国实验用I系小型猪做为脂肪干细胞的来源。本研究从三个方面探讨长期传代后的中国实验用I系小型猪的脂肪干细胞：原代细胞的分离获取，传代后形态，倍增时间，克隆形成率的变化；传代后成软骨能力的变化；传代后成骨能力的变化。第一部分脂肪干细胞的分离、培养、纯化及在体外长期传代后倍增时间和克隆形成率的变化1．1目的体外分离培养中国实验用I系小型猪的脂肪干细胞，在体外长期传代后，取第5，10，15代细胞，分析其细胞倍增时间和克隆形成能力的差异。1．2方法1．2．1脂肪组织的获取和

5、分离培养原代细胞麻醉小型猪，在无菌条件下取少量小猪颈部的脂肪组织(约2-39)，放于PBS中。清洗，剪碎(约lmm3)，尽量去除血管和血细胞。在37*(2下，用0．075％的中山大学硕士学位论文脂肪干细胞在体外长期传代后成软骨成骨能力的变化研究I型胶原酶消化组织30～50min，离心后弃去上层组织残留物和液体，用10％FBS的DMEM液重悬，吸入T-25培养瓶中。培养3天后，用PBS清洗细胞，除去未贴壁细胞，加入新鲜普通培养液。在显微镜下观察原代细胞(即P0)的生长状况和形态。1．2．2细胞的传代、冻存、复苏在原代细胞长到克隆融合时用O．25％胰酶／0．0

6、2％EDTA消化。将细胞分为两份，一份继续传代，一份冻存。冻存时的细胞密度为107／m1。复苏用快速融化法。1．2．3描绘细胞的生长曲线，求出倍增时间同时复苏P5，10，15代细胞，贴壁培养传代一次后消化计数，以每孔5×104个细胞数接种与24孔板中，共接种14孔。每24h数两孔的细胞数，每孔计数两次。共计7天。描绘生长曲线，求出倍增时间。1．2．4细胞的克隆形成率将细胞稀释至lO个／ml培养液，共10ml。将培养液滴于96孔板中，20min后计算每孔的单个细胞数。七天后在显微镜下计算细胞数大于50的克隆数，求出克隆形成率。1．3结果1．3．1原代和传代后

7、的细胞形态和生长状况三天换液后可见长梭型，短梭型，不规则型的单个贴壁细胞。4~5天后逐渐形成克隆，7～lO天克隆融合。此时细胞大部分呈不规则型，折光性差。随着传代次数的增加，细胞形态大部分呈长梭型，涡旋状生长，至15代形态几乎中山大学硕士学位论文脂肪干细胞在体外长期传代后成软骨成骨能力的变化研究没有变化。1．3．2细胞倍增时间不同细胞株之间存在很大的差异。P5的倍增时间可在40～50h之间，PIO的细胞倍增时问在25～40h之间，而P15倍增时间在35～60h之间波动。总体来讲同一细胞株内细胞倍增时问随着传代次数的增加先变短后又增加。1．3．3克隆形成率不

8、同细胞株之间存在很大的差异。P5的克隆形成率在30---45％之间